NF-κB 信號通路在骨性關(guān)節(jié)炎軟骨破壞中的研究進展*

鄭曉慧 董 博 袁普衛(wèi) 鄭 潔△

（1 陜西中醫(yī)藥大學，西安 712046，2 陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院骨病科，咸陽 712000）

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是一類以關(guān)節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)進行性破壞為特點，并伴有滑膜、軟骨下骨及關(guān)節(jié)周圍組織病變的復雜性關(guān)節(jié)疾病。隨著人口老齡化進程的加快，OA 患病率不斷升高。OA 引發(fā)的關(guān)節(jié)功能障礙不僅影響病人的生活質(zhì)量而且是導致殘疾的主要原因。因發(fā)病機制不明，治療OA 的藥物，如非甾體消炎鎮(zhèn)痛藥(NSAIDs)和氨基葡萄糖，僅限于緩解癥狀，無法阻止疾病的發(fā)展進程，手術(shù)通常是治療膝關(guān)節(jié)OA 的最后手段。因此，界定導致OA 啟動和進展的危險因素，有助于揭示該疾病的生物標志物和治療靶點。

關(guān)節(jié)軟骨主要由細胞外基質(zhì) (extracellular matrix, ECM) 和軟骨細胞構(gòu)成，軟骨細胞作為關(guān)節(jié)軟骨中僅有的一種細胞，在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中起著重要作用。生理條件下，軟骨細胞的合成和分解維持著細胞外基質(zhì)的動態(tài)平衡，從而保持軟骨的結(jié)構(gòu)和功能完整性。病理環(huán)境下，炎癥細胞因子、過度的機械應激或ECM 降解產(chǎn)物等因素激活的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子可誘導分解基因轉(zhuǎn)錄，軟骨細胞分解代謝壓倒合成代謝，最終導致軟骨退變，加速OA 進程。此外，NF-κB 轉(zhuǎn)錄因子作為致病因子在OA 中異常激活，還參與了軟骨細胞存活和滑膜炎的相關(guān)活動[1,2]。NF-κB 上游調(diào)節(jié)因子、輔助因子和下游效應因子被認為是OA 治療干預的潛在靶點[1]。近年來，國內(nèi)外學者對NF-κB 信號通路以及相關(guān)調(diào)控機制進行了一系列的研究。本文對NF-κB 在OA 病理生理、關(guān)節(jié)軟骨穩(wěn)態(tài)維持以及在軟骨分解代謝促進作用進行綜述，為OA 軟骨破壞的深入研究及臨床治療方法的確定提供新的研究思路。

一、NF-κB 的一般功能及調(diào)節(jié)

NF-κB 是一種誘導轉(zhuǎn)錄因子，在免疫反應、炎癥反應、細胞分化以及正常細胞和惡性細胞的存活中起著重要作用，關(guān)節(jié)炎、癌癥和自身免疫性疾病和腫瘤等多種病變均存在NF-κB 通路功能失調(diào)的現(xiàn)象。在哺乳動物中，NF-κB 由Rel 家族五個成員的同源和異源二聚體組成，包括NF-κB1 (p105/p50)、NF-κB2 (p100/p52)、Rela (p65)、RelB 和c-Rel。NF-κB信號系統(tǒng)由多達15 種不同的細胞類型和刺激特異性二聚體組合組成。在結(jié)構(gòu)上，反式激活結(jié)構(gòu)域在Rela、RelB 和c-Rel 中是有限的，因此p50 和p52之間的同源和異源二聚體不能作為轉(zhuǎn)錄激活劑。在NF-κB 二聚體中，p65/p50 異源二聚體是其原型，這種復合物存在于大多數(shù)細胞類型中，并作為一種有效的轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮作用。在未受刺激的細胞中，NF-κB 二聚體通過與抑制性IκB 蛋白的相互作用而保留在細胞質(zhì)中。刺激后，IκB 被IκB 激酶 (IκBkinases, IKKs) 磷酸化，并被蛋白酶降解，使游離的NF-κB 復合物轉(zhuǎn)移到細胞核，與NF-κB 反應物結(jié)合激活數(shù)百種免疫調(diào)節(jié)蛋白、促炎細胞因子、趨化因子、粘附分子和生長因子的表達。NF-κB 還誘導IκBα，通過負反饋機制抑制NF-κB。除了動態(tài)亞細胞易位外，NF-κB 活性還受到其翻譯后修飾的調(diào)節(jié)，如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。IκB 家族的兩個非經(jīng)典成員B 細胞淋巴瘤3(Bcl-3)和IκBζ也參與調(diào)節(jié)NF-κB。與經(jīng)典的IκB 蛋白不同的是，它們與細胞核中的p50 或p52 相關(guān)，并選擇性調(diào)節(jié)NF-κB 依賴基因的表達[3]。

激活NF-κB 是由兩種不同的信號通路介導的，即經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路（見圖1）[4]。這些途徑主要由促炎癥信號或因子激活。經(jīng)典通路涉及由p65、c-Rel 和p50 亞基組成的NF-κB 二聚體，需要IKK復合物 (IKKα/β/γ)。由于IκB依賴的負反饋機制，該途徑是快速作用并且可逆的。相反，非經(jīng)典途徑主要通過IKKα 激活p52 和RelB。與經(jīng)典通路相比，非經(jīng)典通路中NF-κB 的激活更慢、更持久。

圖1 經(jīng)典通路和非經(jīng)典通路[4]

二、NF-κB 信號在OA 軟骨細胞分解代謝的作用

生理情況下，關(guān)節(jié)軟骨細胞的合成代謝與分解代謝處于相對平衡狀態(tài)。OA 環(huán)境下，軟骨細胞分解代謝加快，導致軟骨細胞外基質(zhì)完整性被破壞[5]。OA 炎性過程及機械負荷均可激活NF-κB 通路，加速軟骨細胞分解代謝。在培養(yǎng)的軟骨細胞中，用NF-κB 抑制劑治療可降低白細胞介素1β (IL-1β) 誘導的分解代謝基因的表達。在動物模型中，通過IA注射特異性siRNA 技術(shù)敲除NF-κB p65，可減輕損傷誘導膝OA 軟骨病變[6]。因此，了解NF-κB 開啟軟骨分解代謝途徑的機制，可以為OA 軟骨破壞提供新的思路。

1. NF-κB 對基質(zhì)降解酶的異常調(diào)控加速軟骨細胞分解代謝

NF-κB 可直接或間接誘導軟骨細胞外基質(zhì)降解酶和其他OA 相關(guān)因子的表達，并協(xié)調(diào)其他軟骨分解途徑加速OA 軟骨破壞。NF-κB 通過位于基質(zhì)金屬蛋白酶1 (matrix metalloproteinases-1, MMP-1)、MMP9 和軟骨寡聚基質(zhì)蛋白 (a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs, ADAMTS)5 基因啟動子中的NF-κB 反應因子誘導以上軟骨基質(zhì)降解酶的基因表達，并促進OA 主要促炎和破壞性介質(zhì)的表達，包括環(huán)氧合酶2 (cyclooxygenase 2,COX2)、前列腺素E2 (prostaglandin E2, PGE2) 和誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)。NF-κB 還能夠上調(diào)其他轉(zhuǎn)錄因子，如缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor, HIF)-2α、ETS 結(jié)構(gòu)域蛋白1 (ETS domain-containing protein-1, ELK1)和E74 樣因子3 (E74-likefactor 3, ELF3)，進而通過調(diào)節(jié)炎性過程及分解代謝加速OA 軟骨退變。活化的HIF-2α 通過與位于促軟骨分解代謝基因啟動子中的HIF-2α 結(jié)合閾結(jié)合來促進軟骨基質(zhì)降解酶的表達[7]。CCAAT/增強子結(jié)合蛋白β (CCAAT/enhancer-binding protein-β, C/EBPβ) 是HIF-2α 的靶基因，通過直接誘導MMP13 的表達而加重OA 的進展[8]。在堿性成纖維細胞生長因子 (basic fifibroblast growth factor, bFGF) 處理的軟骨細胞中，ELK1 直接增加MMP13 的表達[9]。ELF3 既是NF-κB 的下游靶點和輔助因子，也是NF-κB 信號的激活因子，可驅(qū)動COX2、iNOS 和MMP13 等的基因表達，促進軟骨基質(zhì)降解[10]。這些研究表明，NF-κB 可參與多種基因表達程序，通過多層信號網(wǎng)絡促進軟骨基質(zhì)降解酶、促炎細胞因子及炎癥介質(zhì)的高表達，加快OA 軟骨退變進程。

2. NF-κB 調(diào)節(jié)因子的異常表達加速軟骨細胞分解代謝

軟骨細胞中存在多種可激活或抑制NF-κB 活性的調(diào)節(jié)基因。生理情況下，可激活NF-κB 的基因與抑制NF-κB 活性的基因處于動態(tài)平衡，共同維持軟骨內(nèi)穩(wěn)態(tài)。OA 環(huán)境下，NF-κB 活化因子較NF-κB抑制因子的表達明顯上調(diào)。

（1）通過直接作用調(diào)節(jié)NF-κB 活性的因子：最近發(fā)現(xiàn)IκBζ 可能是代替OA 中NF-κB 發(fā)揮抑制作用的治療靶點。IκBζ 作為非經(jīng)典的IκB 家庭成員，由NF-κB 誘發(fā)，而且又是NF-κB 在免疫細胞中的轉(zhuǎn)錄輔激活物。在軟骨細胞中，IκBζ 過度表達與NF-κB p65、p50 和p52 亞基形成復合物響應IL-1β并增強NF-κB依賴性轉(zhuǎn)錄反應和分解基因的表達[2]。因此，IκBζ 似乎是NF-κB 激活OA 軟骨細胞基因轉(zhuǎn)錄過程所必需的。

轉(zhuǎn)錄因子TCF4 是Wnt 信號通路的下游效應因子。軟骨細胞中TCF4 的過度表達與NF-κB p65 直接結(jié)合誘導MMPs 的表達并加速NF-κB 的激活，從而與NF-κB 的內(nèi)源性抑制劑IκBα 競爭[8]。RNA結(jié)合蛋白SAM68 可調(diào)節(jié)多種細胞類型的NF-κB 活性，在腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor, TNF)-α處理的軟骨細胞中，SAM68 可介導激活NF-κB和分解基因的表達[11]。導入α 家族的成員核轉(zhuǎn)運蛋白α2 (KPNA2) 可調(diào)節(jié)p65 核易位，在IL-1α 處理的軟骨細胞中，KPNA2 促進p65 核轉(zhuǎn)運而加速軟骨細胞的分解代謝[12]。因此，了解干擾NF-κB信號的因子可以為OA 治療提供新方向。

（2）在OA 條件下激活NF-κB 的因子：研究表明OA 關(guān)節(jié)滑膜液和關(guān)節(jié)軟骨中的分泌蛋白或多肽異常積累，分泌蛋白可作為生物標志物發(fā)揮靶向作用。過度的機械負荷已被證明會激活NF-κB 和促進OA 的發(fā)展，而生理負荷能防止軟骨丟失，并抑制NF-κB 在多個方面的激活，包括抑制轉(zhuǎn)化生長因子β 激活激酶1 (TAK1)和IKKβ。雖然小鼠膝關(guān)節(jié)gremlin-1 水平的增加導致了OA 樣表型，但軟骨細胞gremlin-1 的失活可抑制創(chuàng)傷后和自發(fā)性OA[13]。因此，過度機械負荷激活的RAC1-ROS-NF-κB 途徑誘導gremlin-1，使分泌的gremlin-1 進一步激活NF-κB 依賴性軟骨細胞分解代謝并抑制骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs) 依賴性代謝。

傳統(tǒng)的炎性細胞因子（如IL-1β 和TNF-α）治療軟骨細胞已被廣泛用于制備體外OA 模型。而NF-κB 靶基因IL-6 在OA 進展中也有致病作用。最近，IL-36α 作為IL-1 細胞因子亞家族的成員，因在炎癥關(guān)節(jié)中高度表達而被認為是一種有效的OA 誘導因子。研究發(fā)現(xiàn)OA 軟骨中IL-36α 與正常軟骨相比有明顯上調(diào)，并表明在軟骨細胞中IL-36α 的分解作用是通過激活NF-κB 信號。TGF-β-IL-36α 軸被認為是OA 病理中的一個關(guān)鍵信號通路[14]。在正常關(guān)節(jié)中，TGF-β 信號在軟骨細胞中起保護作用。研究發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)損傷使TGF-β2 型受體 (TGFBR2) 失活而觸發(fā)IL-36α 的感應，導致NF-κB 和絲裂原活化蛋白激酶 (MAPK) 依賴的MMP13 激活，并最終導致OA 軟骨破壞[14]。染色質(zhì)蛋白高遷移率組盒1(HMGB1) 具有核因子和細胞外因子的功能，能調(diào)節(jié)IL-1β 誘導激活NF-κB 和軟骨細胞分解代謝基因的表達[15]。這些研究確定了NF-κB 發(fā)揮抑制作用的潛在信號通路和靶點。

（3）在OA 條件下抑制NF-κB 的因子：當NF-κB受到維持軟骨穩(wěn)態(tài)的因子抑制時，OA 的發(fā)展會減慢。這些降低軟骨細胞分解代謝中NF-κB 活性的抑制因子包括Yes 相關(guān)蛋白1 關(guān)鍵效應基因 (YAP1)、皮質(zhì)抑素(CST)、胰島素樣生長因子II (IGF-II)、絲氨酸蛋白酶抑制劑E2 (SERPINE2)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白1 (LRP1) 和細胞因子信號-1 抑制因子(SOCS1)。YAP1 作 為OA 中NF-κB 活 性 的 重 要 負調(diào)節(jié)因子。機制上，炎性細胞因子誘導激活海馬信號并依賴TAK1 降解YAP1，導致IKKα/β-NF-κB 級聯(lián)激活，而通過軟骨特異性敲除YAP1 可增強軟骨細胞分解代謝來擴大實驗OA。此外，在海馬信號通路中，作為YAP1 上游抑制激酶的MST1/2 的下調(diào)減輕了OA 的發(fā)展。CST 可通過與TNF 受體直接結(jié)合而阻滯TNF-α 功能并抑制軟骨細胞中NF-κB的激活。自發(fā)和手術(shù)誘導的OA 模型的研究表明，CST 缺乏導致OA 樣表型加速，而外源性CST 則減弱體內(nèi)OA 的發(fā)展。OA 軟骨中IGF-II 的表達明顯下調(diào)[16]。在小鼠膝關(guān)節(jié)或軟骨細胞中過度表達IGF-II可降低IL-1β 誘導的NF-κB 激活或?qū)嶒炐設A 進展。對SERPINE2、LRP1 和SOC1 的研究僅限于體外軟骨細胞，但這些蛋白對炎癥細胞因子誘導激活NF-κB 激活和分解因子在軟骨細胞中的表達有負調(diào)控作用。這些抑制因子可能有助于克服OA 軟骨破壞中NF-κB激活。

三、NF-κB 相關(guān)表觀遺傳變化在OA 軟骨破壞中的作用

OA 的發(fā)病及進程受到多種表觀遺傳機制的調(diào)控，包括DNA 甲基化、組蛋白修飾和微小RNA(miRNA)[17]。軟骨細胞基因的表達影響OA 發(fā)生和發(fā)展，很多軟骨細胞基因受NF-κB 信號的調(diào)控，這里主要介紹與NF-κB 相關(guān)的組蛋白去乙酰化酶(HDACs)、微小RNA (miRNA)在OA 的作用。

HDACs 由兩大家族構(gòu)成，分別為經(jīng)典的HDAC 家族和NAD+依賴SIRT2 家族。HDACs 影響NF-κB 活性和分解代謝基因在軟骨細胞中的表達。通過抑制經(jīng)典的鋅依賴的組蛋白去乙酰化酶（I類和II 類）或NAD+依賴的去乙酰化酶（III 類）后，觀察到對OA 病理的變化。III 類HDACs，包括SIRT1-7，共有一個共同的催化核心結(jié)構(gòu)域。其中，SIRT1 和SIRT6 可通過直接去乙酰化NF-κB p65 亞基在賴氨酸310 (SIRT1) 或組蛋白H3 在NF-κB 靶基因啟動子 (SIRT6) 的去乙酰化來抑制NF-κB p65 活性[18]。在關(guān)節(jié)中，使用SIRT1 激活劑或SIRT6 過度表達，可抑制促炎細胞因子誘導的軟骨細胞分解代謝基因的表達來減輕實驗性OA 進展，而SIRT1的軟骨特異性敲除加速了OA 的發(fā)展，表明SIRT1和SIRT6 在維持軟骨完整性方面起重要作用。相反，經(jīng)典的組蛋白去乙酰化酶（I 類和II 類）促進OA 的發(fā)展。用泛HDAC 抑制劑如HDAC1-10 或HDAC-6 特異性抑制劑 (ACY-1215) 可抑制軟骨細胞中NF-κB 的激活和IL-1β 刺激的分解基因的表達[17]。另一種泛HDAC 抑制劑TSA 可減輕實驗性OA 進展。這些研究表明，HDACs 對軟骨細胞的基因表達具有重要調(diào)控作用。

與正常關(guān)節(jié)軟骨相比，OA軟骨細胞多種miRNA的表達發(fā)生顯著變化，表現(xiàn)為表達上調(diào)或表達受抑。受NF-κB 信號正調(diào)控的miRNA 包括miR-27b、miR-140、miR-146a、miR-204 和miR-365，而受NF-κB 負調(diào)控的miRNA 有miR-26a-5p、miR-92a-3p、miR-320和miR-558。這說明NF-κB 信號在OA 中miRNA起到重要作用。MIR-365 在OA 病人膝關(guān)節(jié)中表達增加，并通過靶向HDAC4 促進分解因子的表達。由NF-κB 響應衰老信號刺激誘導的miR-204 通過靶向多組分的蛋白多糖生物合成途徑促進OA 軟骨破壞，而抑制miR-204 可改善實驗性OA。研究發(fā)現(xiàn)，許多類型的miRNA 可通過抑制NF-κB 信號通路的基質(zhì)降解酶或分子來抑制軟骨細胞分解代謝。如MMP13 受miR-27b、miR-140 的影響表達上調(diào)和miR-320 的影響表達受抑[19]。而miR-92a-3p 抑制ADAMTS4/5 在軟骨細胞的表達[20]。MiR-138 和miR-9 直 接 抑 制NF-κB 亞 基p65 或p105/50[2,21]。MiR-558 和miR-26-5p 的下調(diào)分別誘導NF-κB 下游COX2 和iNOS 的表達[22,23]。MIR-146a 可通過靶向來自椎間盤的軟骨細胞和髓核細胞中的TRAF6 來降低分解因子的表達，還可通過靶向Smad4 或增加細胞凋亡來破壞TGF-β 信號，從而促進OA 的發(fā)病[24]。最近發(fā)現(xiàn)miR-146a 在OA 中起保護作用，因此miR-146a 基因敲除或抑制劑的IA 治療都能減輕內(nèi)側(cè)半月板失穩(wěn)術(shù) (DMM) 引起的軟骨病變來維持膝關(guān)節(jié)穩(wěn)態(tài)[25]。

四、小結(jié)

在OA 發(fā)生發(fā)展過程中，NF-κB 信號通路通過多種途徑加速軟骨破壞，且與OA 慢性炎癥的發(fā)生、發(fā)展機制有著密切的關(guān)系。因此，全面深入研究NF-κB 信號及其通路在OA 軟骨破壞中的作用有利于進一步闡明OA 炎癥的發(fā)病機制，以便更好地為臨床治療OA 提供全新的方向。