基于軟骨細胞機械敏感性離子通道力學轉導的疼痛機制探討*

許博洋 李浩然 郭 義,4,5△

（1 天津中醫藥大學針灸推拿學院，天津 301617；2 北京大學運動醫學研究所，北京市運動醫學關節傷病重點實驗室，北京 100191；3 天津中醫藥大學中醫學院，天津 301617；4 天津中醫藥大學實驗針灸學研究中心，天津 301617；5 國家中醫針灸臨床醫學研究中心，天津 300381）

骨性關節炎 (osteoarthritis, OA) 是一種慢性滑膜關節疾病，易累及髖膝關節，其主要臨床癥狀是關節疼痛、僵硬和功能下降。在這些癥狀中，疼痛是生物-心理-社去會醫學模式所描述下的臨床決策最主要的參考因素。主要包括兩種疼痛類型（間歇性逐漸加深以及持續性疼痛）。在OA 的早期階段，功能活動引起的可預見性疼痛發作（運動痛）是其明顯癥狀，而持續的疼痛（尤其是在夜間）則常在OA 的中期階段發生?；加型砥贠A 的病人會出現更多的夜間持續性疼痛（靜息痛）表現。疼痛管理不佳將會促使病人不得不進行全關節置換，增加病人的經濟負擔。疼痛作為OA 發生過程中的一種病理主觀感受，具體機制較為復雜。OA 的病理特征是關節軟骨的損傷以及伴隨性的骨組織異常改變。關節軟骨的逐漸喪失將導致關節間隙變窄，同時發生軟骨下骨重塑，骨贅形成和滑膜炎癥。軟骨細胞的大量凋亡是OA 各種病理表現的生物學基礎。但目前軟骨細胞與OA 慢性疼痛之間的聯系較為薄弱，目前國內外均未見有詳細論述。同時OA 本質上是組織生物力學和生物化學耦合作用的病理結局。關節軟骨作為一種機械敏感型組織，是關節的主要承重部位，其提供幾乎無摩擦的支撐面，并可以吸收和傳遞多種機械應力。有研究證實軟骨細胞膜表面存在MSC 可參與調控多條信號通路，并可能介導炎癥及慢性疼痛過程。然而，機械信號轉導背后的具體機制目前尚不明確，涉及軟骨細胞對機械誘導的合成代謝反應的信號通路也未得到很好地描述。本文將主要探討軟骨細胞MSC 機械轉導過程中疼痛發生發展機制，以及與軟骨細胞生理病理功能的聯系，詳細論述機械載荷介導下的軟骨細胞和OA 慢性疼痛之間的聯系，以期為骨關節疾病潛在分子靶向鎮痛藥物的研發提供一定的理論依據。

一、介導骨性關節炎疼痛的生物學機制

以人類膝關節為例，其受到感覺神經（快速傳導的有髓Aδ 纖維、緩慢傳導的無髓C 纖維、粗髓Aβ 纖維）和交感神經末梢神經纖維的支配，它們執行諸如傷害感受，血供調節和本體感受的作用。因此在正常生理條件下，傷害感受器位于除軟骨組織外的整個關節組織中，包括關節囊、滑膜、脂肪墊、韌帶、骨膜和軟骨下骨。而發生OA 后，在壓力和缺氧的條件下包括半月板在內的軟骨組織會遭到破壞，形成缺損并局部新生血管和感覺神經。傳統意義上認為，異常生物力學變化造成關節軟骨受損，可經傷害感受器激活MSC 引起傷害性疼痛。隨著OA 病程的逐漸遞進，其顯現出多因素誘發的復合疼痛跡象（見圖1）。一方面，軟骨細胞的代謝不平衡，將引起炎性細胞因子和基質降解酶的過量產生，再加上同化信號轉導的下調，最終導致組織降解、分解代謝增強。同時伴隨滑膜炎癥，滑膜細胞（成纖維細胞[1]和巨噬細胞）釋放大量免疫炎癥細胞因子到關節內環境中，繼續侵蝕軟骨組織，造成惡性循環。特定介質可通過直接或間接作用使初級傳入神經纖維機械敏感，發生痛覺過敏。同時軟骨缺損后破骨細胞活性也會增強，加速骨組織分解并造成軟骨下骨髓水腫樣病變或暴露軟骨下骨中的神經于關節內環境中，各種炎性介質會刺激神經導致外周敏化并產生炎性疼痛[2]。甚者在持續的傷害感受轟擊下，可導致脊髓背角中的二級神經元興奮性增加。這種中樞敏化的過程增強了傷害感受信號，從而更加放大了疼痛感。另一方面，軟骨損傷后有很大的概率會造成關節內的神經損傷，引起軀體感覺系統的病變或異常疼痛，稱為神經病理性疼痛。OA 神經損傷的調控機制目前尚不明確，可能由軟骨細胞MSC 級聯交互轉導機制有關。由于具體機制并不明確，對常見鎮痛藥并不敏感，目前臨床上大部分采用非局部的全身給藥措施干預。所以于機械載荷作用下的軟骨細胞，在介導OA 的各類型疼痛中均發揮有一定的主導作用，同時可主動調控或被動反饋來自其他細胞（如成纖維細胞、破骨細胞、白色脂肪細胞和巨噬細胞）的病理信號共同調控疼痛過程。

圖1 OA 滑膜關節中的多細胞交互作用

二、機械敏感性離子通道

關節軟骨特殊的生物力學性質可歸因于細胞外基質 (extracellular matrix, ECM) 的分子組成和結構。軟骨細胞作為軟骨組織唯一的細胞類型，負責ECM的生物合成和分解代謝。ECM 主要由膠原纖維網絡（II 型、IX 型、XI 型膠原蛋白交織而成）和夾帶于其中的蛋白聚糖 (proteoglycans, PGs)、糖胺聚糖(glycosaminoglycans, GAGs) 組成，可通過截留溶質和水來創造組織剛性，使軟骨組織能夠承受較大的機械載荷。機械載荷通過ECM 引起的物理刺激可產生跨組織的機械壓力（組織壓）、靜水壓力（液壓）、化學和電信號的變化，從而調節軟骨細胞的代謝活動[3]。在軟骨組織機械轉導的過程中，游離電解質的移動是軟骨細胞對物理刺激的反應基礎。ECM 中PGs 和高度硫酸化GAGs 側鏈上的高負固定電荷吸引移動反作用陽離子，沿PGs 分布產生唐南效應和動電現象，即在維持高滲壓環境的同時進行帶電物質轉運和其他電化學反應，進行生物物理學信號的輸出，引起細胞反應。軟骨細胞表面的MSC 可感受相應離子的變化進行機械轉導以及細胞內信號傳遞的過程。根據機械力的感受機制，可將MSC 分為感受膜傳遞機械力和感受細胞骨架機械力兩大類。軟骨細胞對細胞外生物物理學信號輸入的最早反應之一是細胞內Ca2+水平的一過性升高，通常發生在幾秒至幾分鐘內[4]。MSC 的滲透性激活引發了Ca2+從ECM 自我強化流入胞質的過程。受刺激激活后的軟骨細胞間將通過縫隙連接以鈣波的形式使多個細胞構建信號轉導網絡，最終維持軟骨組織的穩定。目前已明確證實有三種通過調控Ca2+感受機械信號的離子通道，包括電壓門控鈣離子通道 (voltage-gated calcium channels, VGCC)、瞬時感受器電位通道香草素受體 (transient receptor potential channel vanillin receptor, TRPV) 亞家族和Piezo 機械敏感性離子通道。

1.電壓門控鈣離子通道

VGCCs 又稱電壓依賴性鈣通道或電壓激動鈣離子通道，是軟骨細胞感受外界機械載荷變化的關鍵通道蛋白之一。根據α1 亞單位和拮抗劑的種類，可將其分為L 型和非L 型兩大類，非L 型包含四個亞型：R 型、N 型、P/Q 型和T 型（見表1）。另外值得注意的是，L、N 和P/Q 型VGCCC 在高電壓下被激活，R 型VGCC 可被中等電壓被激活，而T 型VGCC 由于在靜息膜電位下被激活而被視為低壓激活的通道蛋白。VGCC 介導Ca2+流入的功能可受到機械應力等多種細胞內外因素的影響，目前僅發現L 型和T 型VGCC 在軟骨細胞表面表達。隨著軟骨細胞ECM 內Ca2+濃度的升高，T 型和L 型的VGCC 介導了Ca2+大量流入軟骨細胞的過程，引起軟骨細胞內Ca2+濃度的升高[5]。這種效應是軟骨細胞感受ECM機械刺激所必經的信號轉導途徑。其中T 型分布較多且占主導地位，軟骨細胞極度依賴T 型VGCC 介導下的鈣離子響應機制。其主要發揮細胞內自發性鈣穩態機制的調節作用，并促進鈣波在級聯細胞網絡中的傳播（見圖2）。在ECM 的機電轉導過程中，由于流體中的游離陽離子和陰離子不平衡，ECM 的壓縮會導致流動電位和擴散電位在組織中同時存在的現象。一方面低電壓會介導細胞膜發生去極化，誘使細胞外Ca2+聚集，進而激活T 型VGCC。另一方面在L 型VGCC 受高壓激動后，其α1 亞基同源結構域中的跨膜α 螺旋胞質內環S4-S6 積極響應，使S4 構象轉化為傳導狀態。此時三者的P 環可共同形成非對稱性的選擇濾孔（離子選擇篩）將僅選擇透過Ca2+。S6 和胞質內S-S 結構域、C 末端共同構成電壓依賴性失活的結構基礎。因此，S6 是大多數L 型VGCC 的特異性孔道拮抗藥物的靶點。VGCCs 也可通過與鈣釋放激活鈣通道耦合形成的蛋白信號受體以及胰島素樣生長因子-1 來參與第二信使Ca2+的分泌。同時有研究提示VGCC不僅能通過感受膜電位變化的方式而介導Ca2+的流入，其也可以特異性識別細胞骨架傳遞的機械應力并且響應這種機械信號。廣義的細胞骨架包括細胞核骨架、細胞質骨架、細胞膜骨架和ECM[6]。整聯蛋白作為聯系ECM 與軟骨細胞內應力纖維的重要組成部分，VGCC 可較好的接受其調控，并與退行性蛋白/上皮鈉通道可形成機械感受絡合物，功能共表達于小鼠肢芽衍生的軟骨細胞。但目前具體機制尚不明確，可能與應力變化時啟動的絲裂原激活蛋白激酶 (MAPK) 和核因子NF-κB 途徑有關。通過激動應力纖維（肌動蛋白絲）的滑動機制產生張力穩定細胞形狀，進一步激活VGCC。

圖2 VGCC 機械轉導機制

表1 VGCC 分型

2.瞬時感受器電位通道香草素受體亞家族

瞬時感受器電位通道 (transient receptor potential channel, TRP) 根據相關蛋白的序列結構可主要分 為7 個 亞 類：TRPC、TRPV、TRPM、TRPA、TRPN、TRPP 和TRPML[7]。其中部分可受局部的機械載荷的作用下激活開放，如TRPV1、TRPV2、TRPV3、TRPV4、TRPM8 和TRPA1[8]等。作為非選擇性陽離子通道，大多數通道蛋白對于Ca2+具有較好的選擇通透性[9]。但實際上TRP 的激活潛伏期較第二信使通路要短，目前除TRPV4 由Ca2+介導以外，其余的其他通道皆為直接門控通道，可直接將機械信號轉化為可傳導的電化學信號。軟骨細胞表面也僅表達TRPV4，而TRPV1 則主要分布于關節滑膜或周圍神經纖維中。在大多數情況下，Ca2+并不直接作用于TRP，而是依賴其C 端的鈣調蛋白(calmodulin, CaM) 結合域發揮作用。因此，Ca2+更可能作為通道的增強劑而不是主要的激活劑。軟骨組織的Ca2+主要有胞外流入和胞內內質網儲存釋放兩個來源。但內質網腔釋放Ca2+的前提是胞外Ca2+的大量流入誘發。軟骨細胞膜表面的TRPV4 可分別介導這兩個過程的胞內外鈣離子傳遞過程。目前TRPV4 的具體機械轉導分子變構機制尚不明確，可能與N、C 末端激動后彼此相互分離靠近的調節功能有關。在使用TRPV4 抑制劑后，會降低力學刺激誘導的軟骨細胞Ca2+的反應以及基質的合成與積聚，表現為對機械載荷和滲透壓敏感性的降低。由于Ca2+-CaM 結合引起的雙相電流變化，TRPV4 也存在一定的反饋調節機制。當其通道被激活，鈣離子內流，胞內鈣離子濃度緩慢升高至閾值水平，接著不同因素激活該通道的速度和幅度可顯著快速提高，Ca2+水平上升；而一段時間后，胞內鈣離子升高至飽和狀態，通道又可被Ca2+的依賴性負反饋機制所阻斷，反映出細胞鈣超載的現象，保護細胞本身不會因為過大的電壓差而出現異常。另有研究發現，TRPV4 不能感知膜傳導的機械力，并且可能在功能上與其他力傳導因子或細胞器耦合。初級纖毛作為軟骨細胞最為重要的機械力感受細胞器，其本身機械轉導功能及結構的完整性是TRPV4 發揮正常生理功能的基礎，力學信號激活TRPV 4，可形成鈣離子微區，同時誘導鈣離子大量內流入纖毛，進而引起下游級聯反應，影響軟骨細胞功能。但目前VGCC 與TRPV 之間并沒有相應聯系。

3. Piezo 機械敏感性離子通道

Piezo機械敏感性離子通道是來源于小鼠Neuro2A細胞系的一種新型非選擇性陽離子MSC，對Ca2+有明顯的偏嗜，其三聚體形成三葉螺旋槳狀結構[10,11]。主要表達于受力學刺激較多的組織中，對壓縮載荷、拉伸載荷以及超聲刺激等機械載荷皆敏感[12]。包含Piezo1 和Piezo2 兩個亞類，是人類已知跨膜區最多的蛋白，并且與目前已知的其他MSC 沒有同源性[13]。通過實驗研究已證實Piezo 的兩個亞型皆在軟骨細胞表面表達。研究發現，Piezo 機械敏感性離子通道通過感受膜傳遞的機械力，介導機械應力激發的軟骨細胞內Ca2+電流，從而在軟骨細胞的機械應力信號轉導中發揮作用。Piezo1 本身的杠桿式機械結構，適合于響應非對稱膜曲率的大幅度變化，可以將遠端刀片型梁結構較大的構象變化有效地轉換為中心離子傳導孔的門控動力源，選擇性的發生陽離子滲透過程[14]。另外，ECM 的膠原纖維蛋白在Piezo1 懸臂的末端修飾包裹，能促進其與細胞的相互作用，在細胞間形成機械聯結網絡，使拉動細胞膜的力量能更有效地激活Piezo1，引發Ca2+內流從而提高Piezo1 對機械力的敏感性。有研究[15]提出，MAPK/ERK5 和 MAPK/ERK1/2 是 Piezo1 介導軟骨細胞在高應變刺激下晚期過度凋亡的下游信號分子。但Piezo 2 在軟骨細胞力學信號轉導機制中的作用目前尚不明確。目前僅發現Piezo1/2 可共同介導的高應變機械轉導過程[16]，并且L 型VGCC在此過程起輔助作用，在Piezo1/2 通道的超生理機械激活后，VGCC 通過軟骨細胞去極化激活并放大Ca2+信號。Piezo 機械敏感性離子通道常用的非特異性拮抗劑包括釕紅、釓三價離子和南美狼蛛提取物GsMTx-4[17]，特異性Piezo1 激活劑包括Yoda1和Jedi1/2[18,19]。但GsMTx4 對Piezo1 并非存在完全的阻滯作用，它通過調節局部細胞膜張力間接產生作用，仍需進一步研究Piezo 的高效阻滯劑。

在MSC 參與軟骨細胞機械轉導的過程中，軟骨細胞對復雜機械環境中不同幅度物理刺激的敏感度不盡相同。其具有一套MSC 的分工負責機制：TRPV4 →Piezo1/2 →Piezo2，它們參與了軟骨細胞由低應變到高應變的力傳遞過程；TRPV4 →Piezo1/2，參與了軟骨細胞從高基質剛度到低基質剛度的機械轉導[20,21]。TRPV4 介導的Ca2+信號在軟骨細胞對正常生理水平應變的反應中發揮主要作用，而Piezo2 介導的Ca2+信號在軟骨細胞對損傷水平應變的反應中起核心作用[22]。此外，TRPV4 和Piezo1 兩者的機械轉導通路彼此分離卻又有重合，它們皆可介導基底扭轉激活電流，以響應以基底為媒介的細胞物理信號輸入過程，但Piezo1 也可響應拉伸激活電流，在TRPV4 缺失或不完善時，進行功能代償行為[23]。

三、機械敏感性離子通道與骨性關節炎

OA 是以生物力學穩態破壞造成軟骨細胞損傷為核心的慢性退行性關節類疾病。正常生理情況下，軟骨組織不受神經支配；而在病理狀態下，OA 關節軟骨中的軟骨細胞作為靶細胞對機械載荷的反應顯著改變，伴隨著軟骨細胞大量凋亡鈣化的同時，已有的血管網絡會從軟骨下骨中向鈣化軟骨層延伸，生長出新的毛細血管。新生血管的形成還參與了骨贅形成以及周圍神經纖維的蔓延。因此異常負荷模式從而引起了關節慢性疼痛的核心癥狀。同時軟骨中新生血管形成與滑膜中的新生血管形成是各自獨立病理過程，這提示我們軟骨組織本身也是OA 病理慢性疼痛產生的重要源頭之一。其相關的疼痛機制是多因素交織的結果，其主要基于機械刺激或MSC 級聯軟骨細胞炎性凋亡通路分泌的炎性細胞因子激活傷害感受器（Aδ 型和C 型傷害感受器），而導致病理性疼痛閾值改變[24]。

1.機械性疼痛

頻繁的機械或溫度刺激易導致外周敏化，可表現為機體機械敏感閾值降低，對機械刺激的敏感性增加，外周傷害感受器高度興奮，疼痛感增強。研究發現某些離子通道或受體的分布及功能變化對外周敏化具有一定影響。TRPV1 可介導包括滲透壓、機械和溫度在內的多重刺激，在周圍神經末梢和傷害感受器中皆表達，同時于OA疼痛模型中高表達[25]。在雖然目前有關TRPV1 機械痛敏的分子機制尚不清楚，但應用其高選擇性激動劑辣椒素可發生外周敏化現象[26]，在將TRPV1 敲除后會出現明顯的機械性刺激閾值降低。同時，作為同族的TRPV4 在OA 早期疼痛中發揮作用，參與了C 型傷害感受器對正常關節的有害機械刺激的反應[27]。并且可能是通過背根神經節神經元的磷酸化而發生外周敏化，應用TRPV4 拮抗劑對OA 疼痛模型大鼠具有較好鎮痛作用[28]。Piezo2 近年來研究發現可介導痛覺感受[29,30]并參與有害機械刺激的轉導[31]，但尚無直接研究Piezo2 在骨髓內傷害感受器中發揮功能的報道。盡管Piezo2 基因敲除后并不能完全阻止傷害感受器轉導機械刺激，但它確實有選擇地降低了Aδ 型纖維機械傷害感受器的敏感性[32]。有研究證實膜聯蛋白A6 作為Ca2+依賴的磷脂結合蛋白超家族的成員，它的過度表達抑制了部分由Piezo2 介導的快速適應電流，減輕了骨性關節炎小鼠模型的機械疼痛[33]。

2.炎性疼痛

異常的機械載荷作用于軟骨組織，會造成關節軟骨結構的改變，軟骨細胞大量凋亡，關節發炎腫脹，炎癥介質和促炎細胞因子傷害感受器，關節間質液增加，對關節內和關節外結構施加壓力，從而通過引起囊內壓力升高也可直接刺激滑膜傷害感受器或機械感受器。其本質在于MSC 介導下軟骨細胞凋亡后殘存的ECM 碎片將刺激關節內環境，產生大量氧自由基和免疫炎癥因子（白介素-1β、腫瘤壞死因子及前列腺素等），刺激軟骨組織新生血管發生缺血再灌注損傷，同時周圍神經纖維分泌P 物質等增強血管內皮細胞的增殖從而造成惡性循環，OA疼痛加劇并構成外周疼痛敏化。MSC 的表達與炎癥的嚴重程度密切相關，主要依賴級聯下游炎性細胞通路（主要是NF-κB 和JNK/SAPK 信號通路）。研究發現TRPV4 可通過介導炎癥NF-κB 信號通路的激活，上調基質金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases, MMPs)的表達，促進軟骨降解，促進疼痛[34]。另外TNF-α 也可通過經典MAPK-p38 炎癥通路調控TRPV4 誘發疼痛[35]。但目前MSC 與下游炎性細胞通路的聯系較為薄弱，理應從機械載荷介導下的細胞交互網絡進行深入的研究。

四、總結

深入了解誘發OA 的生物力學機制對于確定臨床的干預目標至關重要。軟骨細胞是介導OA 疼痛的重要靶細胞之一。軟骨細胞的數量、密度與OA疼痛程度呈明顯負相關。同時軟骨組織是有別于滑膜組織和脂肪組織的另一介導OA 疼痛機制的獨立組織來源。在滑膜關節中，軟骨組織是最大的機械敏感型組織，MSC 大部分都定位表達于軟骨細胞及新生血管、周圍神經纖維表面。因此，MSC 表達和功能的長期變化是OA 疼痛發生機制的關鍵組成部分，并在軟骨細胞膜表面逐漸形成了以Piezo 新型機械敏感性離子通道為核心的第二信使機械轉導途徑，它們可能會驅動各種慢性疼痛狀態下的神經元過度興奮現象。雖然部分MSC 具體的機械轉導機制尚不清晰，但及時的在OA 早期抑制或拮抗相應MSC 的活性，能夠很大程度上緩解疼痛的進程，抑制軟骨凋亡和新生血管的形成。