糖皮質激素受體基因NR3C1 rs7701443 和rs2963156 多態(tài)性與腦小血管病的相關性分析

李靜雅 王 君 莫衛(wèi)焱 任 歆 汪 琦 周衛(wèi)東

1.應急總醫(yī)院神經內科，北京 100028；2.北京市隆福醫(yī)院神經內科，北京 100010

腦小血管?。–SVD）為一種環(huán)境因素和基因遺傳共同作用的疾病，遺傳因素在CSVD 的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。腦缺血后調節(jié)和影響炎癥反應的糖皮質激素受體基因（NR3C1）多態(tài)性與CSVD 的相關性研究備受關注。van Rossum 等[2]研究認為NR3C1 ER22/23EK 位點多態(tài)性是CSVD 中腦白質病變保護因素。預研樣本中未檢出ER22/23EK，中國千人基因組里查找未發(fā)現(xiàn)ER22/23EK 突變型。國內研究發(fā)現(xiàn)[3]，（NR3C1）上rs7701443 和rs2963156 兩個標簽基因多態(tài)性與代謝綜合征風險相關。在單基因位點分析中，SNP rs7701443 AA 和rs2963156 CT、CT/TT 與GG、CC比較，分別獨立增加了代謝綜合征的風險。另一項研究顯示，rs7701443 位點AA 基因型攜帶者的體重指數(shù)（BMI）、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）均高于GG+GA基因型攜帶者。rs2963156位點TT基因型攜帶者的腰臀比（WHR）、TC、LDL-C 等均低于CC+CT 基因型攜帶者。代謝綜合征的危險因素及BMI、SBP、DBP、WHR等亦是CSVD 的危險因素。我國人群NR3C1 與CSVD的相關性尚不明確，因此，有必要對NR3C1 上基因位點進行多態(tài)性研究。本研究旨在分析中國北京地區(qū)漢族人群中NR3C1 rs7701443 和rs2963156 基因位點與CSVD 的關系。

1 對象與方法

1.1 研究對象

CSVD組為2013 年3 月—2018 年5 月于應急總醫(yī)院（以下簡稱“我院”）神經內科前瞻性研究[4-6]收集確診為CSVD 的患者200 例，男74 例，女126 例，年齡（65.49±8.97）歲，均來自同一地區(qū)且非1 級親屬。入選標準：年齡50～85 歲，符合CSVD 診斷標準，診斷標準：按照《中國腦小血管病診治專家共識2015》[5]。對照組為同期我院招募的年齡在50～85 歲，且經MRI 排除CSVD 的正常對照100 名，男33 名，女67 名，年齡（60.17±7.235）歲。本研究已獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準，所有受試者均已簽署知情同意書。兩組均采用統(tǒng)一調查表。

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取 采集受試者靜脈血1～2 mL，用北京博邁德基因技術有限公司全血基因組DNA 快速提取試劑盒（貨號：DL101-01）嚴格按照說明書行DNA 提取。DNA 質檢合格后，存放-20℃冰箱備用。

1.2.2 擴增引物設計和合成 從NCBI SNP 數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）分別獲得rs7701443和rs2963156 位點上下游約300 bp 序列。利用DNAMAN 序列分析軟件設計兩個SNP 位點的擴增引物：rs7701443 正向引物rs7701443-F（5’-ATTCTCTCCATTCATTCCTT-3’），反向引物rs7701443-R（5’-ATTTTCCTAACCTTAAACAC-3’）。rs7701443 變異位點距正向引物5’端109 bp，距反向引物5’端154 bp。rs2963156 擴增正向引物為rs2963156-F（5’-TAGTTGGATGAATTTAGGTG-3’），反向引物rs2963156-R（5’-GGGGTATTTTCCTGTAAGAA-3’）。rs2963156 變異位點距正向引物5’端234 bp，距反向引物5’端155 bp。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.3 PCR 擴增 采用天根生化科技（北京）有限公司高保真TIANSeq HiFi Amplification Mix（貨號：NG219）對目的DNA 片段進行擴增。PCR 擴增體系：TIANSeq HiFi Amplification Mix 10 μL，10 μmol/L 正反向引物各1 μL，基因組DNA 50 ng，加ddH2O 至20 μL。94℃預變性10 min，94℃變性20 s，55℃退火30 s，72℃延伸40 s，共35 個循環(huán)。然后72℃延伸2 min，16℃保存。PCR 擴增均在杭州博日科技股份有限公司Gene Explorer PCR擴增儀器[貨號：TC-96/G/H（b）B]上完成。擴增結束后，吸取PCR 產物5 μL 進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 測序 PCR 產物送北京華大基因生物公司和北京諾賽基因組研究中心有限公司進行一代測序。一代測序采用雙脫氧核苷酸鏈終止法在自動測序儀上進行，用Chromas 軟件對測序峰圖進行分析，根據(jù)測序峰圖結果判定樣品對應基因型。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 24.0 軟件對所得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分比表示，采用χ2檢驗。相對風險率以優(yōu)勢比（odds ratio，OR 值）及其95%可信區(qū)間（confidence interval，CI）表示。以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

遺傳平衡檢查：對2 個SNP 位點（rs7701443 和rs2963156）分別行Hardy-Weinberg 平衡吻合度檢驗，rs7701443 CSVD組χ2=0.014，P=0.993，對照組χ2=0.123，P=0.941。rs2963156 CSVD組χ2=1.127，P=0.569，對照組χ2=0.011，P=0.994。兩組均具有符合Hardy-Weinberg 平衡，樣本具有群體代表性。

2.1 rs7701443 多態(tài)性

2.1.1 兩組rs7701443 等位基因頻率比較 兩組基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表2。

表2 兩組rs7701443 等位基因頻率比較[例（%）]

2.1.2 排除CSVD 危險因素 排除高血壓、冠心病、糖尿病等CSVD 危險因素影響后，兩組基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表3。

表3 兩組rs7701443 基因型頻率比較（例）

2.2 rs2963156 多態(tài)性

2.2.1 兩組rs2963156 等位基因頻率比較 兩組rs2963156 基因型頻率和等位基因頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表4。

表4 兩組rs2963156 等位基因頻率比較[例（%）]

2.2.2 排除CSVD 危險因素 排除高血壓、冠心病、糖尿病等CSVD 危險因素影響后，兩組rs2963156基因型頻率比較，差異無統(tǒng)計學意義（P ＞0.05）。見表5。

表5 兩組rs2963156 基因型頻率比較（例）

3 討論

CSVD 危險因素的影響與以往研究一致[7-14]。本研究未發(fā)現(xiàn)NR3C1 兩個標簽基因位點rs7701443 和rs2963156 與CSVD 相關。

在CSVD 與候選基因多態(tài)性的相關性研究中[15]，至少存在36 個候選基因[4]。Tao 等[16]研究發(fā)現(xiàn)轉化生長因子（TGF）-β1 rs1800470 對CSVD 的腦白質變性起保護功能。Shan 等[17]關于COX2 與CSVD 的相關性研究中示rs689466 和rs20417 對腦白質變性有保護性作用。Li 等[11]報道4 種候選基因（MYLK、AQP4、NINJ2 和INK4/ARF）中15個SNP與CSVD相關性研究，且rs2222823 雜合子和rs2811712 對CSVD 起保護作用。有研究提示[3,18]，rs7701443 和rs2963156 基因位點多態(tài)性與代謝綜合征、心血管疾病中比較，差異有統(tǒng)計學意義（P ＜0.05）。

本研究未發(fā)現(xiàn)這兩種基因多態(tài)性與CSVD 的相關性，可能原因：人種不同；發(fā)病機制不同，CSVD 主要是小動脈、微動脈、內皮細胞受損導致，而代謝綜合征、心血管疾病的發(fā)病機制多傾向于大動脈粥樣硬化[19-25]；該兩種基因多態(tài)性野生型基因頻率低，多數(shù)為多態(tài)性基因型。因此，需要更大的樣本量才可能達到統(tǒng)計學意義，或者等待更多研究報道后薈萃分析后得出明確結論。