茉莉酸處理對木本油料植物小桐子早期花序芽基因表達的影響

徐傳佳，陳茂盛，徐增富，3*

(1.中國科學院西雙版納熱帶植物園,種子創新研究院,中國科學院熱帶植物資源可持續利用重點實驗室,勐侖 666303；2.中國科學院大學生命科學學院,北京 100049；3.廣西大學林學院和亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，南寧 530004)

茉莉酸 (jasmonic acid,JA)在植物花序、小花和雄器官發育過程中具有重要調控作用[1-2]。根據經典的Vick-Zimmerman途徑[3-4]，茉莉酸生物合成最初底物是α-亞麻酸 (α-linolenic acid,ALA)，其由半乳糖脂經磷脂酶A1催化而成；磷脂酶A1包括DONGLE (DGL)，DAD1(deffective in Anther Dehiscence1)和其他未被識別的脂酶[5]。ALA在一系列酶催化下轉化成12-氧代植物二烯酸 [(9S,13S)-12-oxophytodienoic acid,OPDA]。這些酶包括脂氧合酶 (lipoxygenase,LOX)，丙二烯氧合酶 (allene oxide synthase,AOS)和丙二烯氧化物環化酶 (allene oxide cyclase,AOC)。OPDA由過氧化物酶體ABC轉運蛋白 (peroxisomal ABC transporter 1,PXA1)轉運到過氧化物酶體，被OPDA還原酶 (OPDA reductase,OPR)還原成OPC-8:0，隨后經過三步β氧化生成茉莉酸[6-7]。β氧化酶包括乙酰輔酶A氧化酶 (acyl-CoA oxidase,ACX)，多功能酶 (multifunctional protein,MFP)和3-酮酯酰輔酶A硫解酶 (3-ketoacyl-CoA thiolase,KAT)組成[1]。

在擬南芥花藥不開裂基因DAD1(defectiveinantherdehiscence1)突變體中，由于內源茉莉酸含量降低，花絲變短，花粉失活以及花藥開裂缺陷，導致雄性不育[8-9]。kat2kat5雙突變體表現出節間間距異常，花序長度縮短，以及花器官異位的表型[10]。在水稻 (Oryzasativa)中，與DAD1同源的基因EG1(EXTRAGLUME1)突變，會引起花分生組織決定缺陷，改變花器官數量，生成額外的類穎器官，導致小穗形態發生變化[11]。在玉米 (Zeamays)中，茉莉酸合成基因突變體ts1或opr7opr8均表現出穗狀花序由雄蕊向雌蕊逆轉表型，表明JA在玉米花性別決定上起著重要作用[12-13]。

在茉莉酸信號傳遞途徑中，植物響應發育或環境信號，迅速合成具有生物活性的茉莉酸-異亮氨酸 (jasmonoyl-isoleucine,JA-Ile)[14-17]。F-box COI1(CORONATINE INSENSITIVE 1)蛋白感知JA-Ile后，募集不同的jasmonate-ZIM domain (JAZ)蛋白，經26S蛋白酶體使JAZ蛋白泛素化并降解[18-21]。JAZ蛋白降解會解除JAZ-NINJA-TPL(JAZ-NOVEL INTERACTOR OF JAZ-TOPLESS)復合物對JA響應基因的直接抑制，同時使得結合在這些響應基因啟動子上的轉錄因子 (如MYC2)被釋放，調節靶標基因的表達，從而調控植物生長發育和防御響應[19,22-23]。同時，COI1蛋白與SCF(Skp-Cullin-F-box)蛋白特異性結合，形成SCFCOI1蛋白復合體；此復合體通過結合靶向蛋白，調節轉錄響應，進而調控相應的生物學過程[24]。此外，作為JAZ蛋白的靶標，bHLH類轉錄因子中的IIIe亞群 (MYC2、MYC3、MYC4和MYC5)是茉莉酸信號通路中的正調控因子，IIId亞群 (JAM1、JAM2、JAM3和bHLH14)是負調控因子[9,25-28]。在水稻中，JAZ1與茉莉酸受體蛋白COI1b相互作用，引起茉莉酸信號抑制子JAZ1降解，啟動茉莉酸信號，從而調控穗的發育[11]。擬南芥coi1突變體表現為雄性不育，而水稻OsCOI1 RNAi轉基因植株的穗表型沒有明顯變化[29-30]。作為轉錄抑制子，擬南芥JAM1、JAM2和JAM3調控茉莉酸信號途徑，它們的功能增強突變體雄性育性下降[31]。番茄中超量表達SlJAZ2基因引起植株早期葉片發生和開花時間提前以及株高和節間縮短[32]。茄子花藥開裂相關基因SmDAD1的啟動子與GUS基因在擬南芥中異源融合表達，展現出該啟動子在根部、葉片和花藥中的較強活性，且其受逆境和生長發育相關激素的誘導，暗示SmDAD1可能參與茄子發育和脅迫響應過程[33]。以上研究結果表明，在草本植物中，JA合成及信號途徑在植物花發育中發揮著多樣的功能，但是其在木本植物花發育中的調控作用卻鮮有報道[2,32-34]。

小桐子 (Jatrophacurcas)是大戟科多年生木本油料植物，其種子含油率高 (30%～40%)，是種很有潛力的可再生能源植物[35]。然而，小桐子是雌雄同株異花植物，雌雄花比例 (1∶13～1∶29)和種子產量低[36]，限制其生產應用。因此，解析小桐子花性別決定的分子機制對小桐子遺傳改良十分重要。前期通過對雄花退化的小桐子突變體與野生型植株花序的比較轉錄組分析，發現JA在小桐子花發育中可能發揮調控功能[37]，然而其具體作用機制尚不清楚。現通過外源茉莉酸處理小桐子早期花序芽，分析JA對花發育及基因轉錄的影響，為進一步解析JA調控小桐子花發育的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

三年生的小桐子種植于云南省勐臘縣勐侖鎮中國科學院西雙版納熱帶植物園苗圃 (北緯21°54′,東經101°46′;海拔580 m)。茉莉酸購于上海源葉生物科技有限公司 (Cat.No.JJ210510)。茉莉酸溶解在10%乙醇中配成10 mmol/L母液，儲存在4 ℃備用，母液用10%乙醇稀釋成不同濃度后使用。預實驗結果表明，相比2.5 mmol/L和5 mmol/L茉莉酸處理，1 mmol/L茉莉酸處理小桐子花序芽，對花序芽無明顯損傷，故選取該濃度作為處理濃度。于長勢相同的小桐子上，選取出現1～7 d的花序芽 (圖1)為實驗材料[37]，分別用1 mmol/L茉莉酸 (處理組ja1-3)和10%乙醇 (對照組ck1-3)噴施處理[38-39]，24 h后取樣，3～5個花序芽為一個生物學重復。采集的樣品用液氮速凍，保存于-80 ℃備用。另外，用同樣濃度的試劑和相同的處理方法，對同一發育時期的花序芽進行處理，連續處理3次，每次間隔1 d。25 d后，先對未完全開放小花的數量進行統計；待花完全開放后，再對花序進行形態學觀察和雌雄花大小測定。

圖1 出現1～7 d的小桐子花序芽Fig.1 The Jatropha inflorescence bud 1～7 days after emergence

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和測序文庫的構建

花序總RNA的提取采用文獻中描述的硅膠吸附法[40]。用NanoDrop 2000分光光度計 (Thermo Scientific,Wilmington,DE,USA)測定RNA濃度，通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA質量。用Agilent 2100 生物分析儀 (Agilent,Santa Clara,CA,USA)確認RNA的完整性，并通過Qiagen RNeasy kit (Venlo,Netherlands)試劑盒純化RNA。選擇RIN值 (RNA integrity number)大于7的RNA樣品用于建庫。建庫測序由武漢菲沙基因信息有限公司DNBSEQ-G400 (MGISEQ-2000)平臺完成。數據儲存于國家基因庫序列歸檔系統 (China Nucleotide Sequence Archive,CNSA)，項目編號為CNP0001154。

1.2.2 轉錄組分析

Clean reads用Subread (version 1.6.2)軟件 (http://subread.sourceforge.net/)比對到小桐子基因組，并進行基因豐度計算[41]。用edgeR軟件進行差異表達基因 (differentially expressed gene,DEG)分析[42]。使用DAVID軟件進行Gene Ontology (GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)的基因功能富集分析[43]。用pheatmap R軟件包 (version1.0.7)(https://github.com/cran/pheatmap)完成基因的分層聚類。

1.2.3 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(PCR)(qRT-PCR)

用Primer5.0軟件對小桐子花序芽差異表達的候選基因設計qRT-PCR引物 (表1)。以cDNA為模板，以小桐子JcActin(GeneBank No.HM044307)基因為內參[44]，參照SYBR?Premix ExTaqTMⅡ (Roche diagnostics)試劑盒說明書加樣并在LightCycler480熒光定量PCR儀上進行目的基因片段的擴增。實驗進行2次生物學重復和3次技術性重復。結果用2-ΔΔCT方法分析。

表1 qRT-PCR涉及的基因和引物Table 1 Genes and primers used in qRT-PCR

2 結果與分析

2.1 茉莉酸處理對早期花序芽中基因表達的影響

基于轉錄組測序數據 (表2)，對處理和對照樣品進行多維標度法 (multidimensional scaling)分析，其中一個對照樣品 (ck3)出現偏離，去除后處理組與對照組能明顯分開(圖2)，表明JA處理后，小桐子花序芽中的基因轉錄發生了明顯變化。茉莉酸處理后，小桐子花序芽中一共1 954個基因被誘導表達，其中1 259個基因上調表達，695個基因下調表達[變化倍數≥2,錯誤發現率(false discovery rate,FDR)≤0.01](圖3)。GO注釋顯示，在上調表達的DEGs中,主要富集“膜重要組分(integral component of membrane)”“質膜(plasma membrane)”“胞外區(extracellular region)”和“ATP(adenoisine-triphosphate)結合(ATP binding)”功能分類基因；在下調表達的DEGs中，主要富集“葉綠體(chloroplast)”“膜整體組分(integral component of membrane)”“膜類(membrane)”和“氧化還原過程(oxidation-reduction process)”功能分類基因(圖4)。其中“響應茉莉酸(response to jasmonic acid)”功能分類基因出現在上調表達基因群中，表明在小桐子中，外施JA確實可以促進相應信號途徑的基因表達。KEGG注釋顯示“次生代謝物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)”途徑基因在上調和下調表達DEGs中都富集，說明外源JA可能影響小桐子花序芽中次生代謝物的合成 (圖5)。

表2 小桐子花序芽轉錄組測序數據質量統計Table 2 Quality statistics of transcriptome sequencing data for inflorescence bud from Jatropha

ck1和ck2是對照樣品的2個生物學重復；ja1、ja2和ja3是處理樣品的3個生物學重復；BCV表示生物學變異系數圖2 處理和對照樣品關系分析Fig.2 Relationship analysis of sequencing samples based on multidimensional scaling

藍線表示2倍差異表達的基因；紅色點表示FDR小于0.01的差異表達基因；CPM表示每百萬比對到某基因的讀長數圖3 小桐子花序芽中茉莉酸處理誘導的差異表達基因Fig.3 Differentially expressed genes (DEGs)induced by JA treatment in inflorescence buds of Jatropha curcas

2.2 成花轉變、花器官發育以及茉莉酸合成和信號轉導途徑相關的DEGs分析

通過序列相似性比對，在差異表達基因中篩選到10個與成花轉變相關的，8個與花器官發育相關的，8個與茉莉酸合成途徑相關的和10個與茉莉酸信號轉導途徑相關的擬南芥同源基因(P≤ 0.05)(表3)。JA處理后，小桐子花序芽中，參與成花轉變的7個基因上調表達，3個下調表達；參與花器官發育的1個基因上調表達，7個下調表達；參與茉莉酸合成途徑的5個基因上調表達，3個下調表達；參與茉莉酸信號途徑的8個基因上調表達，2個下調表達(圖6)。其中，DAF(DAD1-ActivatingFactor)基因同時參與擬南芥茉莉酸合成和花器官發育過程[45]，MYC4 (myelocytomatosisprotein4)基因同時參與擬南芥茉莉酸信號途徑和成花轉變過程[46-47]，在小桐子花序芽中，其同源基因受JA誘導上調表達。在花器官發育相關的基因中，與擬南芥FUL、SRS、SEP1、AGL61、WOX1、TPR4和SEU同源的基因下調表達，說明JA處理可以誘導小桐子花器官發育相關基因的表達發生變化。為了驗證轉錄組結果中候選基因的表達模式，選取2個成花轉變相關基因(JcSPL4和JcSPL9)、4個花器官發育相關基因(JcFUL、JcSEP1、JcSEUSS和JcWOX1)和2個茉莉酸合成途徑相關基因(JcFAD8a和JcFAD8b)，進行qRT-PCR分析。結果(圖7)顯示，這些基因的表達模式與轉錄組分析結果(圖6)相一致，表明轉錄組測序結果可靠。以上結果表明，外源JA處理可以誘導小桐子早期花序芽中JA合成和信號途徑以及成花轉變和花器官發育相關基因的表達，可能對小桐子花的表型產生影響。

圖4 茉莉酸誘導的差異表達基因的GO功能富集分析Fig.4 Enrichment analysis of GO of differentially expressed genes induced by JA treatment

圖5 茉莉酸誘導的差異表達基因的KEGG功能富集分析Fig.5 Enrichment analysis of KEGG of differentially expressed genes induced by JA treatment

3 討論

茉莉酸生物合成和信號轉導途徑在花的發育過程中起著重要作用，參與擬南芥、水稻和玉米的花發育調控[13,30,69-71]。在小桐子中，不同花性別生態型小桐子比較轉錄組分析結果顯示JA在小桐子花器官發育中可能發揮調控功能[37]，且小桐子茉莉酸合成酶基因JcDAD1的沉默對花發育有明顯的影響[72]，但本研究結果表明外源JA處理并不顯著影響花發育后期表型，表明小桐子的花發育對外源1 mmol/L JA處理不敏感。而外源茉莉酸甲酯(MeJA)可以促進油菜(Brassicanapus)開花，并且引起花器官形態的異常[73]，表明JA調控不同植物花發育過程中的作用方式可能并不相同。

JA處理后，小桐子花序芽中，茉莉酸合成途徑中的FAD7、FAD8、AOC4和OPR3基因下調表達(圖6)，表明內源JA合成受到抑制；而LOX2、LOX5、LOX6和AOS基因上調表達(圖6)，表明小桐子花序芽中可能存在反饋調節。JAZ蛋白是茉莉酸信號途徑中的關鍵蛋白。JA處理后，JAZ1、JAZ2和JAZ8基因上調表達(圖6)，響應茉莉酸含量的增加，表明在小桐子花序芽中，JAZs基因的轉錄受JA正調控。在擬南芥中，JAM2和JAM3蛋白作為茉莉酸信號途徑中轉錄抑制子，其負調控JA響應相關的脅迫響應、花的育性和葉片衰老等過程[74-75]；在小桐子中，JAM2基因上調表達，JAM3基因下調表達，表明JAM2和JAM3在小桐子的花發育過程中可能有不同功能。MYC4是一個受茉莉酸激活的bHLH轉錄因子，擬南芥開花誘導上發揮重要功能[47]。DAD1催化茉莉酸合成途徑中半乳糖脂 (18∶3)向游離的ALA的轉變過程[7]。在小桐子花序芽中，MYC4基因[46-47]以及DAD1激活因子DAF[45]的同源基因表達均被上調，表明在小桐子中可能存在與擬南芥相同的茉莉酸生物合成和信號轉導的調控途徑。

KEGG功能富集分析顯示“次生代謝物合成基因”途徑基因在上調和下調表達DEGs中都富集(圖5)，與JA合成代謝途徑中基因的表達 (圖6)相一致，表明JA合成代謝途徑基因在花發育過程中發揮作用。然而，KEGG并未富集JA信號轉導途徑和花發育相關基因，說明僅僅這些JA合成代謝途徑基因的表達變化可能不足以引起花發育后期(開花期)的表型改變。

表3 成花轉變、花器官發育以及茉莉酸合成和信號途徑相關DEGs統計Table 3 Differentially expressed genes involved in floral transition,floral organ development and JA synthesis and signal pathway

ck為對照;ja為JA處理圖6 茉莉酸信號途徑和花發育相關的差異表達基因聚類分析Fig.6 Hierarchical clustering of differentially expressed genes involved in floral transition,floral organ development and JA synthesis and signal pathway

(a)～(h)分別顯示JcSEUSS、JcSPL9、JcFUL、JcSPL4、JcSEP1、JcWOX1、JcFAD8a和JcFAD8b基因在對照 (ck)和茉莉酸處理 (ja)樣品中的相對表達水平；誤差線代表標準差(n=2)圖7 小桐子中參與成花轉變、花器官發育和茉莉酸合成途徑的候選基因表達模式的驗證Fig.7 Validation of expression profiles of candidate genes involved in floral transition and floral organ development and JA synthesis pathway in J. curcas

本次研究選取出現1～7 d的小桐子花序芽作為實驗對象，事實上花序芽的分化發生在更早的肉眼不可見的時間段[76]。因此，JA處理更早期的未分化的花序芽，可能對花的后期發育影響更顯著。另外，茉莉酸甲酯 (methyl jasmonate,MeJA)是茉莉酸的甲酯化形式，其作為信號分子，自由透過細胞膜，較JA不易被離子化[77]，因此廣泛用于植物脅迫響應和生長發育相關的JA外源處理實驗。鑒于本實驗在田間露天進行，而MeJA具有揮發性，為避免由于環境因素(風向、光照和溫度等)引起MeJA的快速揮發，影響處理效果，故使用茉莉酸作為處理試劑[78]。今后的實驗中將采用MeJA進行處理，了解采用JA與MeJA處理小桐子花序芽的效果是否存在差異。

4 結論

對茉莉酸處理的小桐子早期花序芽進行表型變化觀察和轉錄組測序分析，發現茉莉酸處理引起早期花序芽中1 259個基因上調表達，695個基因下調表達。從轉錄組數據中共篩選到10個與成花轉變相關，8個與花器官發育相關和18個與茉莉酸合成和信號轉導途徑相關的擬南芥同源基因。GO注釋顯示，“響應茉莉酸”功能分類基因在上調表達基因群中富集，表明外源茉莉酸可以改變小桐子花序芽中的茉莉酸信號途徑。在花器官發育相關的基因中，與擬南芥FUL、SRS、SEP1、AGL61、WOX1、TPR4和SEU同源的基因表達下調，然而JA處理后小桐子花的發育后期表型沒有發生顯著的變化，說明茉莉酸誘發的這些基因的下調表達不足以改變小桐子的花器官發育過程。實驗結果對解析茉莉酸在小桐子花發育過程中的調控作用有一定的參考價值。