酶抑制法快速檢測牛奶中β-內酰胺酶抑制劑多殘留

劉鳳銀，李 瀅，王小鵬，吳曉丹，陳鳳燕，梁 岳，袁學文，穆洪濤,

（1.廣東第二師范學院生物與食品工程學院，廣東 廣州 510303；2.廣東省生物工程研究所，廣州甘蔗糖業(yè)研究所，廣東 廣州 510316）

β-內酰胺酶抑制劑是一類小分子化合物，其能夠與β-內酰胺類抗生素競爭性結合耐藥菌產生的β-內酰胺酶，使酶失活，恢復細菌對β-內酰胺類抗生素的敏感性[1-4]。目前常見的β-內酰胺酶抑制劑有舒巴坦、克拉維酸、他唑巴坦和阿維巴坦，結構見圖1。食品中殘留的β-內酰胺酶抑制劑主要有兩方面來源，一是內源性殘留，在動物生產中，為提高抗生素的抗菌作用，β-內酰胺酶抑制劑常與β-內酰胺類抗生素聯(lián)合使用，但由于不規(guī)范用藥甚至濫用問題，導致奶及動物組織中β-內酰胺酶抑制劑殘留[5-7]；二是外源性添加，一些不法商家為掩蓋奶中β-內酰胺類抗生素殘留，加入β-內酰胺酶作為“解抗劑”，同時又加入β-內酰胺酶抑制劑以躲避β-內酰胺酶的檢測，導致奶中β-內酰胺酶抑制劑殘留；增大了奶及肉類的安全風險，對消費者身體健康造成威脅[8-9]。鑒于此，國內外均對β-內酰胺酶抑制劑制定了最高殘留限量（maximum residue limit，MRL），歐洲醫(yī)藥評價局與我國農業(yè)部均規(guī)定牛、羊奶中克拉維酸的MRL為200 μg/kg[10-11]。

圖1 4 種常見的β-內酰胺酶抑制劑化學結構式Fig.1 Chemical structures of four common β-lactamase inhibitors

目前對β-內酰胺酶抑制劑的檢測方法主要有儀器分析法和酶抑制法。前者主要有高效液相色譜法[12-13]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[14-15]和毛細管電泳法[16]等，儀器分析法優(yōu)點在于高準確性、高靈敏度，缺點在于設備昂貴、檢測成本高，對從業(yè)人員的專業(yè)技術要求較高，無法滿足快速、簡便、大樣本量篩查的檢測需求。酶抑制法是基于待測物能夠不可逆地抑制相應酶的活性，根據(jù)酶促反應強度的變化測定待測物的含量，具有靈敏度高、快速簡便、成本低廉及易于基層推廣的優(yōu)點[17-18]。Uri等[19]首次基于克拉維酸能夠不可逆地抑制β-內酰胺酶活性的原理，以肺炎克雷白氏菌的發(fā)酵液作為酶原，頭孢硝噻吩作為顯色底物，建立了一種酶抑制法檢測克拉維酸。后續(xù)關于酶抑制法檢測β-內酰胺酶抑制劑的少數(shù)研究報道，均基于類似原理。如戴西達等[20]將上述原理應用于微生物樣品中克拉維酸的檢測，篩選克拉維酸高產菌株。王斯文等[21]基于該原理，建立了一種β-內酰胺酶抑制劑高通量篩選模型，用于新藥研發(fā)中藥物的篩選。也有研究[22]將該原理應用于食品安全檢測領域，檢測牛奶樣品中的舒巴坦殘留，但報道未提供其他幾種β-內酰胺酶抑制劑的交叉反應率數(shù)據(jù)，同時檢測靈敏度較差，對舒巴坦的檢出限為5 mg/L。目前，我國僅規(guī)定了動物源食品中克拉維酸殘留量檢測的出入境檢驗檢疫行業(yè)標準（液相色譜-串聯(lián)質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法）[23]，尚未出臺其他3 種β-內酰胺酶抑制劑的標準檢測方法。因此，開發(fā)準確靈敏、快速簡便、便于基層推廣的檢測方法，豐富食品中β速內酰胺酶抑制劑殘留的監(jiān)督檢測手段，十分必要。

β-內酰胺酶能夠催化頭孢硝噻吩（淡黃色，λmax=390 nm）水解生成紅棕色化合物（在本實驗體系中，其λmax為488 nm）；β-內酰胺酶抑制劑能夠與β-內酰胺酶產生穩(wěn)定結合，導致其酶活性喪失，抑制上述顯色反應；在一定濃度范圍內，反應體系的顯色強度與β-內酰胺酶抑制劑濃度呈負相關。本研究基于該原理，建立一種酶抑制法，可實現(xiàn)牛奶中的β-內酰胺酶抑制劑多殘留快速高通量篩查。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛奶樣品購于本地超市。

舒巴坦（純度98%） 北京百靈威科技有限公司；克拉維酸鉀（純度95%）、他唑巴坦（純度＞98%）北京伊諾凱科技有限公司；阿維巴坦鈉（純度99%）上海博湖生物科技有限公司；β-內酰胺酶（TEM-1，酶活力3×106U/mL）、頭孢硝噻吩、二甲基亞砜（≥99.9%）、甲酸（色譜純）、乙腈（色譜純） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；96 孔微孔板 廈門怡佳美實驗器材有限公司；其他試劑均為國產分析純；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標儀 上海閃譜生物科技有限公司；PHS-3C精密酸度計 上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司；LC-20ADXR液相色譜儀（配AB SCIEX API4000三重四極桿質譜儀） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗步驟

配制0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS），用于β-內酰胺酶、β-內酰胺酶抑制劑的溶解與稀釋；頭孢硝噻吩用少量二甲基亞砜溶解后，用PBS稀釋至合適濃度。以96 孔微孔板為反應容器，實驗步驟如下：向β-內酰胺酶溶液中加入β-內酰胺酶抑制劑標準溶液混勻進行孵育，再加入頭孢硝噻吩溶液進行水解顯色，采用酶標儀測定各孔吸光度A488nm。上述β-內酰胺酶、β-內酰胺酶抑制劑、頭孢硝噻吩溶液的體積比為1∶8∶1。實驗全程避光反應。

1.3.2 4 種β-內酰胺酶抑制劑的檢測靈敏度初步評價

以0.2 mol/L pH 7.0 PBS分別配制β-內酰胺酶溶液（3×104U/mL），頭孢硝噻吩溶液（0.5 mg/mL），舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉系列濃度梯度標準溶液。按照1.3.1節(jié)方法，37 ℃水浴孵育30 min、顯色1 h進行實驗。分別以β-內酰胺酶抑制劑濃度的對數(shù)值為橫坐標X，吸光度為縱坐標Y，繪制其抑制曲線，計算半抑制濃度IC50，以此初步評價方法對4 種β-內酰胺酶抑制劑的檢測靈敏度。選擇IC50最大的β-內酰胺酶抑制劑進行后續(xù)工作條件優(yōu)化。

1.3.3 最佳工作條件的優(yōu)化

采用單因素試驗，考察緩沖體系pH值（4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、反應溫度（4、25、37、50 ℃）、β-內酰胺酶活力（3.33×103、1.0×104、3.0×104、9.0×104、2.7×105U/mL）、頭孢硝噻吩質量濃度（0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL）、孵育時間（15、30、60 min）和顯色時間（20、40、60、80 min）等理化因素對檢測靈敏度的影響。繪制抑制曲線，從曲線擬合度、最大吸光度Amax、IC50和Amax/IC50等方面綜合評價抑制曲線的性能。

1.3.4 樣品前處理

準確稱取2.00 g牛奶樣品于離心管中，加入2 mL乙腈渦旋混勻，4 000 r/min離心5 min；取出上清液轉移至另一離心管中，加入2 mL正己烷，劇烈渦旋1 min，4 000 r/min離心5 min，收集下層清液，重復2 次；將下層清液40 ℃水浴下用氮氣吹干。加入2 mL PBS超聲復溶，過0.22 μm水相濾膜，用于酶抑制法檢測；加入2 mL 10%乙腈水超聲復溶，過0.22 μm有機相濾膜，用于LC-MS/MS法檢測。

1.3.5 標準曲線的建立與基質效應的消除

取不含有舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦、阿維巴坦鈉和β-內酰胺酶的空白牛奶樣品（β-內酰胺酶抑制劑含量經LC-MS/MS法測定；β-內酰胺酶殘留量按照NY/T 3313—2018《生牛乳中β-內酰胺酶的測定》中第二法膠體金快速試紙條法測定），按照1.3.4節(jié)步驟，進行樣品前處理，制備空白基質溶液。用PBS和空白基質溶液分別溶解稀釋4 種β-內酰胺酶抑制劑標準品，配制一系列濃度梯度的溶劑標準溶液和基質匹配標準溶液。在上述確定的最佳工作條件下進行酶抑制法實驗，分別繪制其溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線。計算出4 種β-內酰胺酶抑制劑的檢出限（IC10）、IC50和線性范圍（IC20～IC80）。

1.3.6 牛奶中殘留β-內酰胺酶對檢測結果的影響

向空白基質溶液中加入β-內酰胺酶，使其終濃度為0、40、200 U/mL，分別以其作為稀釋液，配制一系列濃度梯度的舒巴坦基質匹配標準溶液，進行實驗，分別繪制在基質溶液含有不同β-內酰胺酶濃度水平下的基質匹配標準曲線。考察牛奶中殘留β-內酰胺酶對檢測結果的影響。

1.3.7 添加回收率的測定

向空白牛奶樣品中，分別添加舒巴坦（200、1 000、10 000 μg/kg）、克拉維酸鉀（100、200、300 μg/kg）、他唑巴坦（20、50、100 μg/kg）、阿維巴坦鈉（20、50、100 μg/kg），經樣品前處理后進行添加回收實驗。酶抑制法采用基質匹配外標法定量，計算回收率。同時采用LC-MS/MS法進行測定，比對測定結果。

1.3.8 LC-MS/MS法確證

色譜條件：色譜柱為Kinetex XB-C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；柱溫40 ℃；進樣量5 μL；流速0.4 mL/min；流動相及梯度：A為0.1%甲酸溶液，B為乙腈，0～1.0 min，95% A，5% B；1.0～1.5 min，95%～5% A，5%～95% B；1.5～4.0 min，5% A，95% B；4.0～4.1 min，5%～95% A，95%～5% B；4.1～5 min，95% A，5% B。

質譜條件：電離源為大氣壓電噴霧離子源負離子模式；毛細管電壓4.50 kV；源溫度550 ℃；脫溶劑氣溫度550 ℃；脫溶劑氣流量500 μL/min；錐孔反吹氣流量200 μL/min；電子倍增管電壓2 200 V；檢測方式：多反應監(jiān)測模式；特征離子見表1。

表1 主要質譜參數(shù)Table 1 Main MS/MS parameters

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010進行數(shù)據(jù)分析、表格繪制；采用Origin 2019繪制抑制曲線；采用ChemDraw pro 18繪制化學結構式。

2 結果與分析

2.1 4 種β-內酰胺酶抑制劑的檢測靈敏度初步評價

4 種β-內酰胺酶抑制劑均能抑制β-內酰胺酶活性，但抑制能力不同[24-25]，使得方法對其檢測靈敏度亦不同。實驗結果顯示，在初始條件下，舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的IC50分別為1 190.72、107.34、17.06 μg/kg和22.17 μg/kg，其中他唑巴坦的靈敏度最高，舒巴坦的靈敏度最低。為實現(xiàn)對4 種β-內酰胺酶抑制劑的同時檢測，盡可能地提高對舒巴坦的檢測靈敏度，實驗選擇舒巴坦作為基準分析物，進行后續(xù)工作條件優(yōu)化。

2.2 最佳工作條件的優(yōu)化

選擇曲線擬合度好、Amax較大、IC50較小、Amax/IC50較大的反應條件作為最佳工作條件。得最佳工作條件如下：緩沖體系pH 7.0、反應溫度37 ℃、β-內酰胺酶活力3.0×104U/mL、頭孢硝噻吩質量濃度1 mg/mL、孵育時間30 min、顯色時間1 h。

2.3 樣品前處理方法的選擇

本實驗旨在建立牛奶中4 種β-內酰胺酶抑制劑的多殘留檢測方法，為使在實際樣品檢測中對4 種目標分析物均能獲得較好的回收率，故從4 種化合物的結構性質、實際樣品的基質成分出發(fā)，篩選合適的樣品前處理方法。牛奶中含有大量的蛋白質和脂肪，對其進行除蛋白、除脂處理是檢測前的必要步驟。常用的蛋白質沉淀劑有強酸沉淀劑，如高氯酸、三氯乙酸、濃硝酸等，但舒巴坦、克拉維酸和他唑巴坦均含有一個四元環(huán)結構，在強酸條件下易分解[26]，實驗測試了即使使用有效沉淀牛奶蛋白的最低質量濃度三氯乙酸（在牛奶體系中約18 g/L）進行處理，克拉維酸的回收率亦不足60%；亞鐵氫化鉀和乙酸鋅無機沉淀劑，鄭小嚴等[27]研究發(fā)現(xiàn)該沉淀劑雖能較好地沉淀牛奶中的蛋白質，但會造成舒巴坦、克拉維酸和他唑巴坦的嚴重損失；對有機溶劑沉淀劑如乙腈、甲醇、乙醇、丙酮等，實驗比對了有效沉淀牛奶蛋白所需的4 種有機溶劑的量，其與牛奶的體積比分別為乙腈1∶1、甲醇4∶1、乙醇3∶1、丙酮1.5∶1，乙腈的使用量最小，故實驗采用乙腈作蛋白沉淀劑。克拉維酸的熱穩(wěn)定差，實驗發(fā)現(xiàn)氮吹時水浴溫度超過50 ℃，克拉維酸便有明顯降解，故牛奶樣品經乙腈沉淀蛋白、正己烷除脂后，40 ℃水浴下氮氣吹干，用相應的溶劑復溶備用。

2.4 標準曲線的建立與基質效應的消除

基質成分引起的基質效應嚴重干擾了待測物定量分析的準確性，尤其是針對有復雜成分組成的食品樣品中的待測物檢測，僅依賴簡單的前處理手段，難以很好地消除基質的干擾。目前已有多種消除基質效應的方法報道，其中基質匹配標準溶液法采用不含目標待測物的空白樣品提取液配制標準溶液，建立校正曲線，可同等程度地補償樣品基質對待測物的檢測干擾，是一種有效的、國際上常用的基質效應消除方法[28-29]。

分別繪制4 種β-內酰胺酶抑制劑的溶劑標準曲線和基質匹配標準曲線，如圖2所示。計算不同標準曲線下4 種β-內酰胺酶抑制劑的IC50、檢出限和線性范圍，見表2。雖采用溶劑標準曲線計算時，4 種β-內酰胺酶抑制劑均取得了更低的IC50和檢出限，但從圖2可知，在目前的樣品前處理條件下，仍存在一定的基質干擾，尤其在中低濃度范圍內，有明顯的基質抑制效應，以溶劑標準曲線進行實際樣品檢測時，會影響定量的準確性。故實驗采用基質匹配標準曲線作為標準工作曲線，以消除基質效應對結果準確性的影響，使結果更可靠。

圖2 4 種β-內酰胺酶抑制劑的溶劑標準曲線及基質匹配標準曲線Fig.2 Solvent standard curves and matrix-matched standard curves for four β-lactamase inhibitors

表2 不同標準曲線下4 種β-內酰胺酶抑制劑的檢出限、IC50及線性范圍比較Table 2 Comparison of detection limit, IC50 and linear range for four β-lactamase inhibitors with different standard curves μg/kg

以基質匹配標準曲線作為標準工作曲線，方法對牛奶中舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的檢出限分別為42.88、10.20、1.68 μg/kg和3.48 μg/kg。以克拉維酸的MRL（200 μg/kg）為參考，本方法滿足牛奶中4 種β-內酰胺酶抑制劑殘留的檢測靈敏度需求。

2.5 牛奶中殘留β-內酰胺酶對檢測結果的影響

基于β-內酰胺酶催化頭孢硝噻吩水解顯色的原理，通過測定顯色的強度，間接測定牛奶中β-內酰胺酶抑制劑的含量。若牛奶本身殘留β-內酰胺酶過多，可能會對檢測結果產生影響。研究表明，目前牛奶中β-內酰胺酶的殘留量大多在4 U/mL以下[30]。實驗向空白基質溶液中加入了其10、50 倍濃度水平即β-內酰胺酶含量為40、200 U/mL，考察其對檢測結果的影響，結果見圖3。與不含β-內酰胺酶的基質匹配標準曲線相比，當含量為40 U/mL時，其曲線與前者基本完全重疊，說明該濃度水平下的β-內酰胺酶對實驗結果無影響；當含量為200 U/mL時，在舒巴坦中低質量濃度范圍內，其曲線偏離前者明顯，吸光度較大，易導致假陽性。綜上，β-內酰胺酶殘留量不超過40 U/mL時，對檢測結果的準確性無影響。考慮到在樣品前處理過程中，會導致牛奶中殘留的部分β-內酰胺酶被去除或失活，方法對牛奶中殘留的β-內酰胺酶的實際耐受水平應該更高。

圖3 牛奶中殘留β-內酰胺酶對檢測結果的影響Fig.3 Effect of β-lactamase residue levels in milk on results of detection

2.6 添加回收率實驗

以被測化合物定量離子信噪比為3，確定LC-MS/MS法對舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的檢出限分別0.53、4.45、0.28 μg/kg和0.28 μg/kg；4 種β-內酰胺酶抑制劑在10～500 μg/kg質量濃度范圍內，均呈良好的線性關系。目前我國農業(yè)部僅制定了奶中克拉維酸的MRL。針對制定有MRL的克拉維酸鉀，實驗參照EN 2002/657/EC標準[31]，以0.5、1.0、1.5 倍MRL三個水平進行添加回收試驗；對于未制定MRL的舒巴坦、他唑巴坦和阿維巴坦鈉3 種β-內酰胺酶抑制劑，在其酶抑制法（基質匹配標準曲線）的線性范圍內選取高、中、低3 個水平進行添加。4 種β-內酰胺酶抑制劑的添加量均處于酶抑制法的線性范圍內，且高于LC-MS/MS法的線性范圍下限；當添加量高于LC-MS/MS法的線性范圍上限時，對樣品提取液進行適當稀釋，使其濃度處于線性范圍內。對空白牛奶樣品進行添加回收實驗，比對酶抑制法和LC-MS/MS法的測定結果。從表3可知，采用基質匹配外標法定量時，酶抑制法具有良好的回收率和重復性，平均回收率在80.43%～115.87%之間，變異系數(shù)在1.63%～10.14%之間。LC-MS/MS法的平均回收率在80.08%～104.35%之間，變異系數(shù)在0.60%～5.32%之間。兩種方法檢測結果的相關性見圖4，相關系數(shù)R2為0.982，酶抑制法與LC-MS/MS法測定結果一致性良好，說明本實驗建立的酶抑制法具有良好的準確性。

表3 酶抑制法、LC-MS/MS法對4 種β-內酰胺酶抑制劑的加標回收率測定結果（n=3）Table 3 Recoveries of four β-lactamase inhibitors from spiked milk samples by the enzyme inhibition method and LC-MS/MS (n= 3)

圖4 酶抑制法和LC-MS/MS測定結果相關性曲線Fig.4 Correlation of LC-MS/MS results with enzyme inhibition results

3 結 論

4 種β-內酰胺酶抑制劑除阿維巴坦之外，均含有四元內酰胺環(huán)，在強酸強堿條件下易降解。以牛奶為篩查對象，為使酶抑制法對每種目標分析物均能獲得較為理想的添加回收率，實驗對比了多種樣品前處理方法，發(fā)現(xiàn)以乙腈沉淀蛋白、正己烷除脂、氮氣吹干后用等量PBS復溶，采用基質匹配標準溶液法消除基質干擾，4 種β-內酰胺酶抑制劑均獲得了良好的添加回收率。

對于牛奶中可能殘留的β-內酰胺酶，推測其可能會對檢測結果產生影響[32]，并給出了去除牛奶中微量β-內酰胺酶的方法，即采用強酸（鹽酸和硝酸的混合液）沉淀蛋白后，再用氫氧化鈉調節(jié)pH值至中性。考慮到克拉維酸的酸敏感性，該樣品前處理方式并不適用于β-內酰胺酶抑制劑的多殘留檢測。同時本研究發(fā)現(xiàn)，在該酶抑制法體系下，牛奶中少量的β-內酰胺酶殘留（不超過40 U/mL），不會影響檢測結果的準確性。

實驗基于酶抑制法原理，建立了一種β-內酰胺酶抑制劑多殘留快速檢測方法，最佳工作條件為測定波長488 nm、緩沖體系pH 7.0、反應溫度37 ℃、β-內酰胺酶活力3.0×104U/mL、頭孢硝噻吩質量濃度1 mg/mL、孵育時間30 min和顯色時間1 h。在牛奶樣品中，對舒巴坦、克拉維酸鉀、他唑巴坦和阿維巴坦鈉的檢出限分別為42.88、10.20、1.68 μg/kg和3.48 μg/kg，滿足牛奶樣品的檢測靈敏度要求。相較于目前報道的β-內酰胺酶抑制劑單殘留快速檢測方法，如戴西達等[20]建立的克拉維酸單殘留檢測法、沙芳芳等[7]建立的舒巴坦ELISA法，該酶抑制法能夠在一次分析實驗中，同時篩查4 種β-內酰胺酶抑制劑，在分析通量、成本和實用性方面，具有突出優(yōu)勢。實驗豐富了β-內酰胺酶抑制劑的檢測方法，對牛奶中β-內酰胺酶抑制劑殘留標準檢測方法的建立提供參考。