基于氮穩定同位素比例質譜和液相色譜-高分辨質譜的有機番茄鑒別

王世成，李國琛，王 瑩，李 波，高凝軒，孫 辭，宋 陽，王顏紅

（中國科學院沈陽應用生態研究所，遼寧省農產品環境與質量安全控制工程技術研究中心，遼寧 沈陽 110016）

近年來，農業生產從數量滿足型向質量需求型轉變，環境友好型的循環農業也日益凸顯優勢。隨著生活水平的提高，消費者需求也逐漸從傳統食品升級為綠色食品、有機食品。有機食品在生產過程中拒絕使用化學性肥料和農藥，因而具有較高的安全性和經濟價值。受利益驅使，一些不法商家隨意標注“有機”字樣，假冒“有機食品”坑害消費者。歐洲議會“公共衛生和食品安全委員會”將有機食品列為10 個風險較高的摻假食品的第3位[1]。因此，鑒別有機產品的真實性對于保障消費者安全和市場誠信，保護消費者和有機品牌的經濟利益至關重要。

在對有機與非有機種植模式的農產品鑒定研究中，有近紅外光譜[2]、高效液相色譜[3-4]和氮同位素比例質譜[1,5]等技術得到應用，但僅通過一種檢測手段或只對單一目標物檢測的技術很難滿足鑒別需求，將光譜、色譜以及質譜結合的組學及化學計量學分析技術已逐漸成為研究熱點[6]。

有機食品是指根據有機農業生產的規范生產加工并經過認證的農產品和加工品。有機食品禁用化肥，允許施用有機肥，土壤有機肥的施用是種植業有機產品生產的主要控制要素[7]。研究表明[8-10]，化學肥料中δ15N的豐度變化范圍小，平均值為0.2‰，而有機肥料中δ15N的豐度變化范圍大，平均值為8.5‰，有機肥中15N同位素豐度高于化肥中15N豐度。有機模式種植的農產品主要施用有機肥，不施用化肥，因此致使農產品中氮同位素比值（δ15N）存在差異，通常表現為有機產品中δ15N高于施用化肥的普通產品。農產品中δ15N豐度依次為施用有機肥＞不施肥（土壤內源氮）＞施用化學合成氮肥[11]。對有機番茄的化學成分研究表明[12-13]，有機番茄中山柰酚、槲皮素等類黃酮化合物高于普通番茄，且有機種植的番茄中的類黃酮含量隨種植時間延長而增加，而傳統種植的類黃酮含量并無顯著差異。因此，利用氮穩定同位素結合化學成分的變化，可以甄別有機食品與普通食品。本實驗對有機和普通種植番茄的穩定同位素比值特征與化學組成成分進行對比研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄：番茄樣品共計94 個，包括寶石、大紅、3944、安哥拉等大果番茄品種，其中有機番茄樣品50 個，普通番茄樣品44 個。采集于2017年6月至10月期間。地點分別位于遼寧沈陽新民、沈陽法庫、江蘇南京、山東濰坊、四川西昌的有機番茄及附近的普通番茄生產基地，其中有機番茄采自當地按有機種植方式生產的有機農場或企業。每個產地樣品的采摘方式為隨機選擇10 個有機種植模式的番茄植株和普通種植模式的番茄植株，在植株的不同部位采摘成熟度一致的果實。為增大采集樣品數量，每株植株隨機摘取4～6 枚果實，所摘取的番茄大小均勻，具有代表性。每個植株的番茄為1 組。樣品的來源及相關信息見表1。

表1 有機與普通番茄樣品的產地來源Table 1 Geographical origins of organic and common tomato samples tested in this study

甲醇、乙腈（均為色譜級） 德國默克公司；乙醇、甲酸（均為色譜級） 天津市科密歐化學試劑有限公司；超純水經Millipore超純水系統純化。

1.2 儀器與設備

HPLC-Q Exactive高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜（high performance liquid chromatographyhigh resolution mass spectrometry，HPLC-HRMS）聯用儀美國Thermo Scientific公司；Deltaplus XP穩定同位素比例質譜（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）儀、Flash EA1112元素分析儀、ConFlo III元素分析儀-IRMS連續流接口 美國Thermo-Finnigan公司；SQP電子天平賽多利科學儀器（北京）有限公司；KQ-250B型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；TTL-DC氮吹儀II型 北京同泰聯科技發展有限公司；CT15RE冷凍離心機 日本日立公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品的制備

采集獲得的番茄樣品洗凈切片，混勻后，用勻漿機打碎，冷凍干燥成粉末，過20 目篩放于－80 ℃備用。

1.3.2 HPLC-HRMS分析

凍干后的樣品，稱量約150 mg，加入3 mL水-乙醇（1∶4，V/V），超聲30 min后，4 000 r/min離心15 min，取2 mL上清液于氮氣流下揮發（45 ℃）至近干。殘渣加水-甲醇（1∶4，V/V）2 mL進行復溶，超聲30 min，4 ℃、14 000 r/min離心15 min，過0.22 μm濾膜，分取1.5 mL上清液于液相進樣瓶中，進行分析。

1.3.3 氮同位素比值測定

凍干后的樣品，分別稱量約2 mg，并用錫杯包裹壓實，利用元素分析儀-同位素比值質譜儀測定穩定氮同位素比值。每份樣品重復3 次，并根據下式計算δ15N值[14-17]：

式中：（15N/14N）樣品為樣品穩定氮同位素比值；（15N/14N）標準為標準物質穩定氮同位素比值。

1.3.4 液相色譜條件

采用Waters Atlantis T3色譜柱（2.1 mm×150 mm，3 μm）；流動相為0.1%甲酸-乙腈溶液（A）和0.1%甲酸溶液（B）；流速0.3 mL/min；柱溫45 ℃；梯度洗脫條件：0～0.5 min，5% A，95% B；0.5～5 min，5%～30% A，95%～70% B；5～9.5 min，30%～90% A，70%～10% B；9.5～9.75 min，90%～5% A，10%～95% B；9.75～12 min，5% A，95% B。進樣體積5 μL。

1.3.5 高分辨質譜條件

電噴霧離子源；噴霧電壓3.2 kV；蒸汽溫度350 ℃；離子傳輸管溫度320 ℃；鞘氣流速35 arb；輔助氣流速15 arb；Full MS-ddMS2掃描模式，Full MS質量掃描范圍m/z100～900，一級分辨率70 000，二級分辨率17 500。

1.3.6 同位素比值測試條件

元素分析系統氧化柱填料Cr2O3/Co3O4，溫度為960 ℃，還原柱填料為高純Cu/CuO，溫度為640 ℃，載氣He流量為90～100 mL/min，氧噴條件為175 mL/min。

1.4 數據處理

HPLC-HRMS數據采用Thermo Scientific公司的Xcalibur4.0數據軟件進行原始數據采集。Compound Discover軟件（version 3.0, Thermo Scientific）對總離子流圖中的色譜峰進行時間和峰對齊校正、濾噪，數據處理分析，與數據庫進行計算匹配。處理結果導出樣品名稱、保留時間、分子式、分子質量、質荷比以及對應的離子峰面積強度組成的數據集。主要參數設置如下：保留時間范圍為1～12 min；質荷比范圍為m/z100～900；偏差為5×10－6；信噪比為3；保留時間漂移值為0.2 min。得到的峰面積利用SIMCA-P 11.5軟件（Umetrics, Umea, Sweden）進行化學計量學分析。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）非監督分析方法進行探索性數據分析，實現樣本間分析聯系的可視化。使用SIMCA-P剔除異常值樣品，使用有監督的偏最小二乘-判別分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）方法對樣本及已確定的類別進行建模[18-22]。采用多變量和單變量分析選擇法選定差異顯著的變量，篩選出統計學意義顯著的化合物[23-26]。化合物的初步鑒定是在準確的物質組成基礎上進行，從精確質量數、同位素組成及分布與預測分子式的吻合度、一級質譜/二級質譜碎片和數據庫匹配等方面進行推測。

IRMS數據利用SPSS 19.0軟件進行統計分析，并利用Excel和Origin 8.5軟件進行繪圖統計處理。

2 結果與分析

2.1 穩定同位素比值分析

2.1.1 有機與普通番茄穩定氮同位素比值的差異分析

利用元素分析儀-IRMS測得不同地區50 種有機種植番茄樣品以及44 種普通種植番茄樣品，由圖1A可以看出，有機番茄δ15N值的中位值在8.68‰左右，而普通方式種植的番茄δ15N值的中位值則為3.61‰，有機番茄氮同位素比值明顯高于普通番茄。有機番茄的肥料主要為有機肥，普通番茄主要施用化肥。有機肥以畜禽糞便、動植物殘體等富含有機質的副產品資源為主要原料，Peterson等[10]研究發現，植物氮源主要來自于土壤中動植物腐爛物質及動物排泄物。由于15N與14N在生物體內反應所需能量不同，反應速率存在差異，造成15N在生物體內產生富集。因而有機肥15N豐度高于化肥，有機肥中高含量的15N使有機作物果實中15N比例增高[8,11]。

圖1 所有樣品（A）及不同產地來源（B）的有機與普通番茄穩定氮同位素比值Fig.1 Stable nitrogen isotopic ratios of organic and common tomato samples (A) and samples from different geographical origins (B)

所有有機和普通番茄穩定同位素比值在一定范圍內互有重疊（圖1A），但按4 個地區分組比較發現，同一地區所產有機番茄的δ15N均高于普通番茄，并且存在顯著差異（P＜0.01），且無重疊（圖1B）。因此，可以通過比較同一地區番茄的δ15N初步判斷是否為有機番茄。進一步比較有機番茄和普通番茄種植土壤的同位素比值發現，除四川西昌外，其他4 個地區的有機番茄土壤的δ15N值也均高于普通土壤，多年有機種植模式下土壤中氮同位素比值有增加的趨勢。但統計分析發現除四川土壤外，其他地區的有機和普通土壤二者無顯著差異（圖2）。

圖2 土壤及對應番茄穩定氮同位素比值Fig.2 Sable nitrogen isotope ratios of soil and corresponding tomatoes

2.1.2 番茄與對應的土壤氮同位素變化特征

番茄與對應土壤的δ15N值對比發現，除遼寧一個產地（法庫）外，其他4 個產地有機番茄的氮同位素比值均高于對應的土壤同位素比值（圖2）；除山東外，普通番茄δ15N值均低于對應的土壤（圖2），在土壤氮源中δ15N豐度差異不顯著的情況下，施用外源肥料后，有機番茄主要吸收有機肥中的高δ15N的有效氮，導致有機番茄中δ15N高于土壤的δ15N，普通番茄吸收無機肥的低δ15N有效氮，導致普通番茄的同位素比值低于土壤同位素比值[8]。

2.2 液相色譜高分辨質譜分析番茄化學組成成分

2.2.1 液相色譜分析結果

分別采集番茄樣品的HPLC-HRMS正離子和負離子模式的總離子流色譜圖。圖3為具有代表性的有機番茄樣品正離子模式指紋圖譜。在正離子模式下共有約25 個明顯可見的色譜峰，而在負離子模式下，樣品出峰較少，在扣除試劑空白后，僅有5 個明顯的色譜峰存在。

圖3 番茄樣品的HPLC-HRMS總離子流色譜圖（正離子模式）Fig.3 HPLC-HRMS total ion current chromatogram of tomato samples (in the positive ion mode)

2.2.2 液相色譜-高分辨質譜的多元統計判別分析

94 個樣品的色譜峰面積經SIMCA-P軟件剔除異常值樣品，獲得符合要求的樣品91 個，隨機取56 個作為訓練集，其中有機樣品28 個，普通樣品28 個，35 個作為驗證集樣品，其中有機樣品20 個，普通樣品15 個。

應用Compound Discover軟件，對色譜峰進行峰對齊、保留時間校正和濾噪處理后，提取其中的所有質譜信息。使用軟件的化合物篩查過濾模式，提取化合物峰面積大于105，且60%以上樣品都有響應的化合物組成成分，提取其中的875 個化合物的峰面積數據。采用SIMCA-P軟件進行PCA和PLS-DA，PCA不能將樣品很好分開，采用PLS-DA提取3 個PC，模型解釋的訓練集累計貢獻率（R2Y）達到0.915（通常R2越接近1，模型越良好），模型交叉驗證對訓練集預測的累計貢獻率（Q2）為0.539（通常Q2＞0.5表明模型對新數據的預測能力良好）。采用Permutation校驗方法[21]驗證模型是否存在過擬合現象（圖4），通過200 次迭代的排列測試，模型結果顯示Q2點散射回歸線與垂直軸的截距小于零，說明PLS-DA模型驗證結果良好，數據模型擬合成功，模型可靠。建立的模型能夠實現2 組樣本完全分離，模型的總預測正確率為92.3%（表2）。

圖4 PLS-DA模型的200 次permutation校驗結果Fig.4 Results of verification of PLS-DA model with 200 permutation tests

表2 模型對有機和普通番茄的判定結果Table 2 Results of the model for organic and common tomatoes

2.2.3 有機番茄和普通番茄組成成分的單變量差異性分析

采用Compound Discover軟件，同2.2.1節處理，對番茄樣品的HPLC-HRMS組間數據峰面積均值進行比對，形成單變量統計分析結果的火山圖（圖5）。圖中框圖標注區域為有機番茄和普通番茄單變量統計差異顯著（P＜0.05），并且有機番茄相比于普通番茄（普通/有機），面積比值增加（log2fold change＜0.5）或降低（log2fold change＞2）的特征化合物，共有18 個，這些化合物成分在有機和普通番茄中存在較大差異，需進一步確證。

圖5 不同化合物的有機與普通番茄組間的火山圖Fig.5 Volcano plots showing differential compounds between organic and common tomatoes

2.2.4δ15N與HPLC-HRMS組合的化學計量學判別分析

為了提高模型的預測能力，將δ15N數據與875 個色譜峰數據合并形成新的數據集，采用SIMCA-P軟件進行PLS-DA，提取3 個PC，模型解釋的訓練集累計貢獻率（R2Y）達到0.918，交叉驗證模型預測的訓練集累計貢獻率（Q2）為0.559，模型預測的正確率為93.4%（表2）。與δ15N變量加入前相比，信息提取率、預測能力和準確率均有一定提高。前3 個PC的得分圖上，2 組樣本實現了完全分離（圖6a）。在前2 個PC的載荷圖（圖6b）中，距離原點最遠的變量為318.07和δ15N，說明這2 個指標對判定有機番茄的貢獻最大，其次為分子質量192.03、208.15、274.19、159.07、609.39、305.27、453.29 Da等變量，也有可能成為有機和普通番茄產生差異的主要標志化合物。

圖6 有機和普通番茄的得分圖（a）及載荷圖（b）Fig.6 Score plot (a) and loading plot (b) for organic and common tomatoes

2.2.5 特征變量因子篩查與確證分析

將SIMCA-P軟件多變量處理結果與Compound Discover軟件單變量分析的結果相結合，進一步篩選特征化合物，以更全面闡明有機和普通樣品之間的差異化合物成分。單變量處理的組間存在顯著差異（P＜0.05）的219 個變量中，滿足多變量處理變量重要性投影（variable importance in projection，VIP）大于1.0的變量153 個，其中VIP值大于1.5的變量53 個，這53 個化合物可能成為有機番茄和普通番茄具有顯著差異的特征化合物。這些化合物與采用Compound Discover處理的火山圖結果（圖5）中的18 個化合物中有14 個一致，這14 個成分中有9 個化合物在有機番茄中含量低于普通番茄，有5 個高于普通番茄，說明通過簡單的化合物峰面積比較可初步發現存在含量差異的化合物。

針對篩選出的除δ15N以外的152 個變量，通過精確分子質量、二級質譜分析，并檢索mzclound、chemspider、massbank、KEGG等數據庫，結合文獻[27-31]，初步確定mzclound數據庫匹配度大于70%，在有機與普通番茄中存在差異的13 個化合物，見表3。在這些化合物中，主要為有機酸、黃酮類化合物，這兩類化合物是番茄中的主要抗氧化成分。與普通番茄組相比較，有機番茄中的小分子有機酸含量降低，黃酮類化合物槲皮素-3-O-三糖苷的含量增加。這與已有研究結果基本一致，環境脅迫可激活番茄植株體內苯丙醇類化合物的生物合成，有機處理的番茄中類黃酮含量隨種植年限增加而增加，而傳統處理的類黃酮含量并無顯著差異[5,12]。

表3 初步確定兩組間差異顯著的化合物信息Table 3 Information about significantly differential compounds between organic and common tomatoes

3 結 論

本實驗采用IRMS和HPLC-HRMS分析技術，借助PLS-DA技術建立一種有機番茄鑒別方法。有機和普通種植方式所生產的番茄，其果實中穩定氮同位素比值差異顯著。可結合地區特征，通過穩定氮同位素比值大小在一定程度上判定樣品是否為有機番茄。為進一步提高判別效果，將液相色譜高分辨質譜分析數據與穩定碳同位素比值相結合，構建了有機番茄判別模型，篩查出特征變量因子，包括穩定氮同位素比值，50多個可能的化學成分，鑒定出其中的13 個化合物，可作為有機和普通番茄區別的特征成分。所建立的模型對有機番茄的判別正確率為93.4%，基本可以滿足有機番茄判別的需要。對有機產品的判定，穩定氮同位素差異分析更為簡潔方便，但由于有機與普通產品的穩定氮同位素比值界限時有重疊，給判定增加了不確定性，因此應該進一步結合液相色譜-串聯質譜的組學技術，提高判別的可靠性。