基于IRAE-HS-SPME/GC-MS分析殺青方式對綠茶栗香形成的影響

王華杰，滑金杰，余勤艷，江用文，王近近，楊艷芹，鄧余良，袁海波

（中國農業科學院茶葉研究所，國家茶產業工程技術研究中心，農業農村部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，浙江省茶葉加工工程重點實驗室，浙江 杭州 310008）

綠茶是我國產銷量最大的茶類[1]，具有一定的防癌、抗氧化、抗輻射等功效[2]。香氣是評判綠茶品質的關鍵因子，決定其市場價值[3]。綠茶根據香型可分為清香型、花香型、栗香型、甜香型，其中栗香型是我國中高檔綠茶的典型代表，深受消費者喜愛[4-6]。綠茶香氣形成與加工工藝密切相關，其中殺青是綠茶香氣形成的關鍵工序，通過高溫熱作用迅速鈍化酶活性，固定葉內生化成分，保持綠葉、清湯；同時在高溫作業下茶在制品的香氣化合物發生劇烈轉化反應，呈香類型發生轉變，低沸點呈青草味的青葉醇、青葉醛等物質大量揮發，高沸點香氣物質逐漸呈現，新型呈香化合物逐漸形成[7]。

現應用于生產的殺青方式主要有鍋炒殺青、熱風殺青、蒸汽殺青、滾筒殺青等[8-12]，鍋炒殺青、熱風殺青升溫迅速，所制綠茶香高味醇，但殺青技術參數難掌控，易出現悶黃、焦邊爆點等問題[13]；蒸汽殺青穿透力強、用時短，可有效保留葉綠素，但香氣物質轉化不足[14-15]；廣泛應用于生產的滾筒殺青，高溫長時利于香氣物質充分的轉化，利于綠茶栗香形成，且滋味鮮醇，但葉片與筒壁長時間摩擦發灰；相比于傳統殺青方式，新興的微波殺青不僅對茶葉色澤有利，且可有效保留品質成分，但香氣不高；遠紅外可利用高溫射線，使茶葉迅速均勻升溫，可作為輔助殺青使香氣進一步提升[6]。為克服單一殺青的弊端，研究人員對聯合殺青技術進行了初步探索：其中微波-遠紅外聯合殺青處理有利于綠茶色香味的保留，所制綠茶高香鮮嫩、滋味醇厚[16-19]；滾筒-微波聯合殺青處理所制的殺青葉、成品茶葉香氣均高于單一滾筒殺青。但現有聯合殺青技術的研究，多以人工感官評判為主，研究結果精準性較差，缺乏說服力，未進行客觀香氣成分的比較以及系統性探索。如何將利于栗香形成的傳統滾筒殺青與新興的微波、遠紅外更好聯合，提升綠茶整體品質，以及更加客觀地評價綠茶香氣品質需要進一步深入研究探討。

此外，現有關栗香綠茶的研究多集中于特征成分的找尋以及干燥工藝方面[20-21]，而殺青工藝方面的研究較少，鮮見殺青方式對綠茶栗香形成影響系統的研究。本實驗以利于栗香形成的滾筒殺青為基礎，設定滾筒-微波、滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外、滾筒-遠紅外-微波4 種新型分時分段聯合殺青方式組合。結合人工感官審評，應用紅外輔助固相微萃取技術、氣相色譜-質譜聯用技術、多元統計分析探明栗香關鍵組分及不同殺青方式對其形成的影響，從而明確綠茶栗香形成的最佳殺青方式，為實際生產提供理論依據和技術指導，為實現定向化、標準化加工優質栗香綠茶提供研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“福鼎大白”品種鮮葉原料，嫩度為一芽一二葉，開化，采摘日期為2019年4月。

癸酸乙酯（色譜純） 梯希愛化成工業發展有限公司；正構烷烴 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；蒸餾水 杭州娃哈哈集團有限公司。

1.2 儀器與設備

80型電磁滾筒殺青機 余姚市姚江源茶葉茶機有限公司；6CW-6E型微波殺青機 江蘇農業機械化研究所；DXCWS-05型茶葉遠紅外提香機 宜興市鼎新微波設備有限公司；6CR-25型揉捻機 浙江上洋機械有限公司；JY-6CHZ-7B型茶葉烘焙提香機 福建佳友機械有限公司；Quintix224-1CN型分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；20 mL頂空瓶、密封帽、7890B-7000C氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司；手動固相微萃取手柄、二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supe1co公司；紅外燈 浙江海寧市奇異照明電器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制茶流程及工藝參數設置

攤放：在設施攤放室內進行，設定溫度（20.0±1.0）℃，相對濕度（58±3.0）%，攤放時間12.0 h，至含水率約70%，進行殺青。

殺青：以滾筒殺青為對照，設定滾筒-微波殺青、滾筒-遠紅外殺青、滾筒-微波-遠紅外殺青、滾筒-遠紅外-微波殺青，結合產業實際及前期預實驗結果，具體參數設置如表1所示。

表1 殺青工藝參數設置Table 1 Parameter settings for fixation

揉捻：殺青葉攤涼1.0 h后進行揉捻，以空揉10 min→輕揉10 min→中揉10 min→輕揉5 min進行，總計35 min，成條率達90%以上。

干燥：毛火，110 ℃，葉厚2 cm，烘干約15 min，含水率約20%，攤涼30 min；足火，90 ℃， 烘30 min，至含水率小于7%。

1.3.2 茶葉香氣分析

1.3.2.1 試樣前處理

參照紅外輔助頂空固相微萃取技術，稱取0.5 g茶葉（精確至0.001 g）于20 mL頂空瓶中，加入10 μL癸酸乙酯（20 mg/L）、1 mL沸蒸餾水后立即擰緊頂空瓶蓋，將DVB/CAR/PDMS纖維頭手動刺穿瓶蓋隔膜，置于100 W的紅外裝置下照射15 min，然后將纖維頭插入氣相色譜-質譜進樣口，250 ℃解吸5 min；每個樣品重復3 次[22]。

1.3.2.2 氣相色譜-串聯質譜聯用分析

氣相色譜條件：HP-5ms Ultra Inert毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純He，流量為1 mL/min；進樣口溫度250 ℃；程序升溫：初始柱溫50 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升至150 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min 升至270 ℃，保持6 min；分流模式：不分流進樣[23]。

質譜條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；質量掃描范圍35～400 u。

1.3.2.3 定性定量

定性：通過Agilent MassHunter未知物分析程序，經NIST 11標準譜庫檢索，按相似度大于80%的原則篩選化合物，再根據正構烷烴C7～C40在氣相色譜-質譜下的線性公式計算各個化合物的保留指數，并與文獻中的數值比對，以保留指數相差30以內為標準再次篩選化合物。

定量：采用內標法，按式（1）計算各個化合物的質量濃度：

式中：Ci為任一組分的質量濃度/（μg/L）；Cis為內標的質量濃度/（μg/L）；Ai為任一組分的色譜峰面積；Ais為內標的色譜峰面積。

1.3.2.4 OAV的計算

氣味活度值（odor activity value，OAV）指香氣組分在樣品中的濃度與氣味閾值之間的比值。按式（2）計算：

式中：C為組分在樣品中的質量濃度/（μg/L）；T為對應組分在水中的氣味閾值/（μg/L）[21]。

1.3.3 品質感官評價

參照GB/T 23776—2018《茶葉感官審評方法》，由5 位高級評茶員組成品質評定小組，取約50 g茶樣，把盤、評外形，后稱取3 g茶樣，加入150 mL沸水沖泡4 min后進行密碼審評，采用評語與百分制打分相結合的方式評定茶葉品質，評定外形、香氣、湯色、滋味、葉底，每項100 分，另熱嗅、溫嗅對樣品栗香香氣強度以10 分制打分；冷嗅時對栗香香氣持久度以10 分制打分。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 殺青方式對綠茶感官品質的影響

如表2所示，殺青方式對綠茶的香氣、滋味影響顯著，對外形、葉底影響較小。香氣方面，不同處理茶樣均可表現出栗香香型，但栗香高度和持久度存在顯著差異，滾筒-遠紅外-微波殺青處理栗香高揚持久為最優，滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青處理栗香較高，持久性較好次之，而滾筒殺青、滾筒-微波殺青栗香表現較差，持久性不佳；滋味方面，滾筒-遠紅外-微波殺青滋味鮮爽得分最高，滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青鮮味不足次之，而滾筒殺青、滾筒-微波殺青略帶澀味得分最低。總分來看，呈滾筒-遠紅外、滾筒-遠紅外-微波殺青＞滾筒-微波-遠紅外殺青＞滾筒-微波殺青＞滾筒殺青的規律，即滾筒-遠紅外、滾筒-遠紅外-微波聯合殺青整體感官品質較佳，其中滾筒-遠紅外-微波聯合殺青所制茶樣栗香表現最優。

表2 殺青方式對綠茶感官品質的影響Table 2 Effect of fixation methods on sensory quality of green tea

以滾筒殺青為對照，滾筒-微波聯合殺青對綠茶品質的改善和提升作用不明顯，微波殺青升溫過快，迅速固定茶葉品質，致使色、香、味相關品質成分不能進一步充分發生熱物理化學反應[15]，使栗香及其前體物質形成不足；滾筒聯合遠紅外殺青可有效提升綠茶栗香強度以及滋味鮮爽度，遠紅外殺青以高能射線穿透葉組織，溫度迅速升高，葉細胞破碎率高，從而利于高沸點香氣物質的轉化與形成，利于蛋白質、多糖裂解為氨基酸、可溶性糖，同時酯型兒茶素裂解為簡單兒茶素，因此酚氨比、酯型兒茶素與簡單兒茶素之比降低，從而澀味減少[24-26]；滾筒-遠紅外聯合殺青首先使品質成分溢出并充分發生反應后，再聯合微波殺青可促進品質成分進一步形成，促進熱化學反應而生成較多高沸點物質，因此滾筒-遠紅外-微波聯合殺青處理茶樣栗香高揚持久，滋味鮮爽。

2.2 殺青方式對綠茶香氣成分形成的影響

2.2.1 殺青方式對香氣成分含量的影響

不同殺青方式所制綠茶成品中共檢測出68 種香氣化合物，如表3所示，含量較高的香氣化合物有：芳樟醇、(E)-芳樟醇氧化物（吡喃類）、松油醇、香葉醇、順-3-己酸己烯酯、茉莉酮、香葉基丙酮、反式-β-紫羅酮、2,4-二叔丁基苯酚、棕櫚酸乙酯、植醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等，其中順-3-己酸己烯酯、芳樟醇、松油醇、茉莉酮、香葉基丙酮、反式-β-紫羅酮等化合物在滾筒-遠紅外-微波殺青中含量顯著最高，這些物質在已有研究中被認為對栗香形成具有重要貢獻[5,20,27-29]；植醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、1-十四醇等具有青草香的物質在滾筒殺青、滾筒-微波殺青處理下含量較高，這些低沸點化合物可能對栗香形成不利[6]，從而導致滾筒殺青、滾筒-微波殺青處理茶樣栗香表現較差。

表3 不同殺青方式下茶樣香氣化合物及含量Table 3 Type and contents of aroma compounds in green tea samples prepared by different fixation methods

續表3

滾筒聯合遠紅外殺青，可利用高能射線穿透茶葉，增加了細胞破碎率，香氣及其前體物質在高溫下充分反應，形成高沸點化合物，后加上微波，3 次熱作用使高沸點化合物如芳樟醇、反式-β-紫羅酮等大量形成，因此滾筒-遠紅外-微波殺青栗香鮮明、持久；單一滾筒或滾筒聯合微波殺青導致香氣化合物不能充分發生熱化學反應，不利于生成高沸點香氣物質或其前體，因此滾筒殺青、滾筒-微波殺青處理較形成和保留較多亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、1-十四醇等，而滾筒-微波-遠紅外殺青處理，在第2步的微波殺青不能充分激發栗香組分或其前體，然第3步遠紅外殺青后形成的部分香氣化合物散失，導致栗香品質不如滾筒-遠紅外-微波殺青。

2.2.2 殺青方式對綠茶香氣類別的影響

香氣成分類別含量及配比的不同對綠茶香型及香氣濃度呈顯著影響[21]。本研究中檢測到的68 種香氣成分總含量呈滾筒殺青＞滾筒-微波殺青＞滾筒-遠紅外-微波殺青＞滾筒-遠紅外＞滾筒-微波-遠紅外殺青的規律（圖1A），其中包含醇類11 種、酸類1 種、酯類12 種、醛類4 種、酮類9 種、烯烴類5 種、醚類1 種、酚類1 種、芳香烴類2 種、碳氫化合物19 種、其他類3 種，其中醇類、酯類、酮類、酚類、碳氫化合物、醚類相對含量較高。如圖1B所示，滾筒-遠紅外-微波殺青處理下醇類、酮類、芳香烴類的相對含量顯著最高，這幾類物質通常呈現出良好的烘烤香、花果甜香[21]；酯類、醚類在滾筒殺青、滾筒-微波殺青處理下含量較高；滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青處理各香氣類別相對含量中等。結合感官審評及各香氣化合物含量可得，滾筒-遠紅外-微波殺青利于高沸點醇類、酮類化合物的形成從而栗香鮮明，滾筒殺青、滾筒-微波殺青處理下生成較多的醚類、酯類導致栗香表現相對較差，滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青處理下各類化合物含量居中，栗香高度和持久度得分處于滾筒-遠紅外-微波殺青與滾筒殺青、滾筒-微波殺青之間。

圖1 不同殺青方式茶樣香氣成分類別質量濃度圖（A）及占比柱狀圖（B）Fig.1 Contents (A) and percentages (B) of different classes of aroma compounds in green tea samples prepared by different fixation methods

2.3 殺青方式對栗香綠茶關鍵差異化合物的影響

2.3.1 PLS-DA

偏最小二乘-判別分析（partial least-squares discrimination analysis，PLS-DA）在茶葉品質客觀評價中廣泛應用[30-31]，是一種具有監督的判別分析方法。基于成品茶測得的68 種（表3）香氣成分，以5 種殺青處理為因變量，分析不同殺青方式下綠茶栗香濃度高低的關鍵差異物質。由圖2可知，5 種殺青處理可實現明顯區分，以橫坐標為界限滾筒殺青、滾筒-微波殺青聚在得分圖的正上方，滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青聚在圖的左下方，滾筒-遠紅外-微波殺青分布在圖的右下方。這與感官審評結果相一致（表2），滾筒-遠紅外-微波殺青表現為栗香高揚持久，其次是滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青，而滾筒殺青、滾筒-微波殺青栗香高度和持久度較低，即該模型根據栗香強度將茶樣進行準確區分；該模型共篩選出5 個主成分，模型對自變量擬合指數為R2X=0.965，對因變量擬合指數為R2Y=0.992，模型預測指數為Q2=0.974，R2X越接近于1，模型越穩定，R2Y越大，模型解釋能力越強，Q2越接近于1，表明模型預測率越高[32]，因此該模型具有極強的累積解釋度和預測能力，穩定可靠。

圖2 不同殺青方式綠茶香氣成分的PLS-DA得分圖Fig.2 PLS-DA score plot for aroma substances in green tea samples prepared by different fixation methods

為進一步找出不同殺青方式下影響栗香強度的關鍵差異化合物，利用PLS-DA的變量投影重要性（variable important for the projection，VIP）圖量化變量對分類的貢獻度，一般認為VIP值大于1為分類貢獻度較大的變量[33]。結果如圖3所示，結合差異顯著性分析（表3），共獲得二甲醚、2-(甲氧基)-1-苯基-乙酮、松油醇、α-二去氫菖蒲烯、2,4-二叔丁基-苯酚、順-3-己烯酸-順-3-己烯酯、α-畢橙茄醇、棕櫚酸乙酯等21 種香氣差異化合物，其中松油醇、α-二去氫菖蒲烯、順-3-己烯酸-順-3-己烯酯在已有研究中被認定為判別栗香的重要變量[4,21]。結合2.2節分析可得，聯合殺青方式及順序的不同對香氣成分影響顯著，殺青方式不同傳熱機理導致茶葉細胞破碎率的不同，化學反應存在差異，導致香氣含量及類別不同，最終導致香型及香氣強度的不同。

圖3 香氣成分PLS-DA模型的VIP條形圖Fig.3 VIP bar plot of PLS-DA model for green tea aroma substances

2.3.2 層次聚類分析

基于成品茶中檢測到的68 種香氣成分，對5 種殺青處理進行聚類分析，結果如圖4所示，滾筒殺青與滾筒-微波殺青聚為一類，滾筒-遠紅外與滾筒-微波-遠紅外殺青聚為一類，最終4 種殺青方式聚為一類，而滾筒-遠紅外-微波殺青自成一類，該結果同主成分分析結果一致（圖2）；由68 種香氣成分貢獻度可知，α-二去氫菖蒲烯、順-3-己烯酸-順-3-己烯酯、順-3-己酸己烯酯、雪松醇、月桂烯、D-檸檬烯、壬醛、香葉醇、苯乙醛、反式-β-紫羅酮、茉莉酮、香葉基丙酮等物質對高栗香表現的滾筒-遠紅外-微波殺青處理貢獻突出，這些物質常呈現烘烤香、花果香、木香，對栗香構成具有重要作用[4,5,20]；滾筒殺青、滾筒-微波殺青處理下，植醇、葉綠醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯、1-十四醇等物質顯著高于滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青、滾筒-遠紅外-微波殺青處理，這些物質常呈青草香，對清香型綠茶貢獻較大[6]，不利于栗香的形成。

圖4 不同殺青方式下綠茶香氣成分分布熱圖Fig.4 Heat map showing the distribution of aroma compounds in green tea samples prepared by different fixation methods

結合VIP值，共獲得α-畢橙茄醇、棕櫚酸乙酯、松油醇、α-二去氫菖蒲烯、順-3-己烯酸-順-3-己烯酯、順-3-己酸己烯酯、雪松醇、月桂烯、D-檸檬烯、壬醛、香葉醇、苯乙醛、芳樟醇、反式-β-紫羅酮、茉莉酮、香葉基丙酮16 種栗香重要組分。

2.3.3 OAV分析

OAV是評價香氣成分呈香貢獻度的客觀指標，OAV大于1為組分對香氣有貢獻，OAV大于10為香氣構成重要組分[34]。基于PLS-DA和層次聚類分析篩選得到的香氣差異化合物，通過閾值查找，獲得10 種香氣差異化合物OAV及呈香特征，如表4所示。不同殺青方式茶樣中反式-β-紫羅酮OAV達5 000以上，對香氣組成具有極大貢獻；芳樟醇、順-3-己酸己烯酯、雪松醇等OAV大于1，對香氣組成有貢獻；香葉醇、苯乙醛在滾筒-遠紅外-微波殺青處理下OAV大于1；芳樟醇、反式-β-紫羅酮、順-3-己酸己烯酯、雪松醇、壬醛等的OAV均以滾筒-遠紅外-微波殺青顯著最高，對栗香構成貢獻突出；結合感官審評，滾筒-遠紅外-微波殺青栗香強度表現最高，其次是滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青、滾筒殺青、滾筒-微波殺青栗香表現較差；結合層次聚類分析中部分香氣成分在滾筒殺青、滾筒-微波殺青貢獻顯著高于滾筒-遠紅外、滾筒-微波-遠紅外殺青處理，但香氣是不同成分在一定濃度和配比下呈現，且相互存在復雜的協同和拮抗作用[35]，如葉綠醇、植醇、1-十四醇、亞油酸乙酯、亞麻酸乙酯等成分可能會削弱栗香的強度，最終導致栗香感官得分的差異；即滾筒-遠紅外-微波利于花果香、木香等高沸點物質反式-β-紫羅酮、芳樟醇、順-3-己酸己烯酯、壬醛、香葉醇、苯乙醛等的形成，栗香鮮明。順-3-己烯酸-順-3-己烯酯、茉莉酮、香葉基丙酮雖未找到香氣閾值，但本實驗及相關研究均發現其為栗香構成重要組分[4]。

表4 殺青方式對栗香關鍵香氣成分OAV的影響Table 4 Effect of fixation methods on OAVs of key odor compounds responsible for the chestnut-like aroma of green tea

3 結 論

不同聯合殺青方式對綠茶感官品質影響顯著，尤其是香氣、滋味方面。滾筒聯合遠紅外可有效提高栗香品質，其中以滾筒-遠紅外-微波聯合殺青處理最優；滾筒聯合微波使品質成分未充分發生反應和轉化，對栗香改善作用不大，同時由于栗香前體物質未被充分激發，因此第3步再聯合遠紅外提升效果不如滾筒-遠紅外-微波。聯合殺青方式及順序的不同對香氣成分含量及配比影響顯著，滾筒聯合遠紅外殺青利用高能射線二次高溫處理，利于高沸點醇類、酮類如反式-β-紫羅酮、芳樟醇等的形成和轉化，其中以滾筒-遠紅外-微波殺青含量最高，利于栗香的形成。PLS-DA模型可根據綠茶栗香濃度將5 種殺青方式明確區分，獲得21 種香氣差異化合物，結合MEV分析最終獲得：α-畢橙茄醇、棕櫚酸乙酯、松油醇、α-二去氫菖蒲烯、順-3-己烯酸-順-3-己烯酯、順-3-己酸己烯酯、雪松醇、月桂烯、D-檸檬烯、壬醛、香葉醇、苯乙醛、芳樟醇、反式-β-紫羅酮、茉莉酮、香葉基丙酮16 種栗香重要組分。OAV分析篩選出反式-β-紫羅酮、芳樟醇、順-3-己酸己烯酯、壬醛、香葉醇、苯乙醛6 種明確的栗香關鍵組分，未找到閾值的順-3-己烯酸-順-3-己烯酯、茉莉酮、香葉基丙酮[20-21,29]等物質同樣是栗香重要構成。滾筒-遠紅外-微波聯合殺青三重熱作用可有效促進這些成分的形成，從而栗香鮮明，為綠茶栗香形成的最佳殺青方式。

本實驗通過殺青方式的創新，將產業上應用較廣泛的殺青技術進行組合，避免單一殺青技術造成風味不佳的問題，同時通過紅外輔助固相微萃取技術、氣相色譜-質譜聯用技術檢測香氣，明確聯合殺青技術對內在香氣成分的影響，獲得最適綠茶栗香品質形成的聯合殺青方式。后續研究需進行聯合殺青工藝參數的優化，獲得優質栗香綠茶最佳聯合殺青參數，從而為定向化、標準化生產優質栗香綠茶提供技術指導。