不同寡營養條件下副溶血性弧菌的生長異質性

張布克，史 俊，潘迎捷,,3，趙 勇,,3，劉海泉,,3,4,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.農業農村部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室（上海），上海 201306；4.上海海洋大學食品熱加工工程技術研究中心，上海 201306）

在天然的生態環境中影響副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus，Vp）生存的因素有很多，溫度、鹽度、pH值等都是影響Vp生長的重要環境因子；除此之外，寡營養條件也是影響自然界中Vp生長的環境因子。自然環境下土壤和海洋中含有的營養含量都非常低，而且大部分不可被菌株利用，任何一種營養物質的缺乏都能導致菌株進入寡營養條件[1]。

自然界中不同Vp菌株處于寡營養狀態下會形成不同的生長特性[2]，有的Vp菌株在長期寡營養條件下呈活的不可培養狀態[3-4]，有的Vp菌株可以通過細胞外部形態和內部生理結構的逐步變化在寡營養條件下存活相當長時間[5-6]。同種屬Vp菌種不同菌株在實驗室中通過單一培養后，菌株間會出現的生長行為、遺傳和生理等方面的差異性，這種表現被稱為微生物的異質性[7-8]。而生長特性方面的差異，稱之為生長異質性[9-10]；除此之外還有毒力、失活以及生物被膜形成異質性等[11]。微生物生長方面異質性主要通過生長參數延滯期、最大比生長速率及最大菌濃度表現。Murphy[12]和Anderson等[13]在研究中提到微生物異質性是菌株的特性，不會隨實驗的次數而改變。研究Vp菌株生長異質性能降低菌株生長異質性對風險評估的影響，從而真實地反映菌株的差異性。

由于弧菌引發的疾病具有發病率高、流行性廣、危害嚴重等特點，每年給海產品養殖業造成了巨大的損失[14-17]；此外，消費者攝入了含有致病性Vp的食品后可引起腹瀉、腹痛、惡心、嘔吐、腸胃炎等疾病[18]。國內外目前都有因Vp引起食源性疾病的病例[19-20]。國內外Vp生長異質性主要包括不同海產品，不同溫度、鹽度、pH值條件下的研究[21-24]，而對于寡營養條件下的生長異質性預測尚待明確。實驗室課題組已經做了不同溫度鹽度、耐藥性及食品介質條件下Vp生長異質性的比較研究[25]，研究寡營養條件下Vp的生長異質性有助于建立更加完善的食品中Vp生長異質性研究網絡體系。

本研究探討Vp在寡營養條件下的生長異質性，有助于闡明微生物在自然環境中的生長規律，進而幫助進行更精準的食品安全風險評估和更科學的食源性致病菌疾病防控。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗采用的20 株不同Vp菌株，分別從淡水、海水養殖蝦中分離。其中Vp1、Vp3、Vp6、Vp7、Vp9、Vp11、Vp12、Vp14、Vp16、Vp17、Vp18、Vp19、Vp20分離自淡水養殖蝦，Vp2、Vp4、Vp5、Vp8、Vp10、Vp13、Vp15分離自海水養殖蝦。在制備樣本前，所有菌株保存于25%甘油管中，存放在－80 ℃冰箱內。

TCBS培養基、胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養基 北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C全自動微生物生長曲線分析儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab公司；MLS-3750型高壓滅菌鍋日本三洋電機生物醫藥株式會社；全自動臺式離心機德國Eppendorf公司；OptiMair?垂直流超凈工作臺、Airstream?A2型二級生物安全柜 Esco China公司；GHP-9270型隔水式恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化與接種液制備

預實驗得到Vp菌株在低于25%標準TSB+（3%NaCl，下同）占此的培養基稀釋液中無明顯生長活動，因此選擇100%、75%、50%和25%標準TSB+占此的培養基稀釋液范圍作為培養菌株的寡營養條件，參照Liu Bingxuan等[25]Vp菌株的活化及接種液制備方法，當菌株生長到達指數后期（109CFU/mL）時，再從每個試管中每次吸取10 μL菌液分別接種至100%、75%、50%和25%標準TSB+占此的培養基稀釋液中，然后用磷酸鹽緩沖液調節菌濃度（OD600nm值），使其約在0.3～0.6之間，并以此為初始接種液。

1.3.2 不同寡營養條件中Vp生長實驗

在全自動微生物生長曲線分析儀配套的100 微孔板中分別加入180 μL寡營養條件為100%、75%、50%和25%標準TSB+占此的培養基稀釋液，分別吸取初始接種液20 μL接種至對應梯度的培養液中，并分別加入10 孔 200 μL 100%、75%、50%和25%標準TSB+占此的培養基作為空白對照，每株菌4 種生長條件，3 個平行，2 個對照，3 次獨立重復實驗，將已加樣品液和空白對照的100 微孔板放入全自動微生物生長曲線分析儀樣品槽中，將儀器設置為每1 h讀取OD600nm值一次，培養溫度設定為37 ℃，測定Vp的生長曲線。

1.3.3 生長動力學參數的擬合

1.3.3.1 微生物預測一級模型

參照Liu Bingxuan[25]、Ma Fengli[26]等和姬華[27]分別使用修正Gompertz模型、修正Logistic模型、Baranyi模型得到菌株的延滯期（λ）、最大比生長速率（μmax）、最大生長密度（ymax），計算擬合相關系數（R2）、均方根誤差（root mean square error，RMSE）、準確因子（Af）和偏差因子（Bf）、變異系數（coefficient of variation，CV），稍作調整。模型表達式如下：

修正Gompertz模型：

式中：A為最初的細菌接種量OD值；C為最大菌種量與初始菌種量OD值之差；μm為最大比增長速率/h－1；t為時間/h；λ為延滯期/h。

Baranyi方程：

式中：y（t）為任意時間菌量（OD值）的對數值；y0、ymax為y（t）的初始值和最大值；A（t）為達到漸近線的最大菌量（OD值）；μmax為最大比生長速率/h－1；λ為延滯期/h；m、v、q0為模型參數。

修正Logtistic模型：

式中：y、A和C都與修正的Gompertz方程中的參數意義相同；B、M為模型參數。

μmax、λ、CV計算公式如下：

本研究應用Origin 9.1軟件（OriginLab公司）描述Vp的生長曲線，修正Gompertz模型和修正Logistic模型選用Origin 9.1軟件進行擬合，而Baranyi模型采用原英國食品研究所開發的DMfit軟件對Vp的生長數據進行擬合，得到擬合相關系數（R2）。

1.3.3.2 微生物預測二級模型

二級模型首先用修正Ratkowsky（μmax-N）和Nonlinear Arrhenius（λ-N）模型[28]進行擬合，由于擬合系數過低或無法擬合，本實驗主要采用生長參數折線圖直觀比較，通過折線圖對二級生長參數直觀比較。

1.3.3.3 模型評價

相關系數R2值在0～1之間，且越靠近1即表明預測模型的參考價值越高。計算公式如下：

RMSE是說明模型預測值的離散程度的一種數值指標。計算公式如下：

準確因子（Af）和偏差因子（Bf）計算如下：

Af=1說明預測值與實驗觀測值相等，Af值越大表明預測模型與觀測值的平均精準度偏低；Bf主要用于判斷預測模型的偏差度，Bf＝1，說明所選用模型的擬合結果與實驗觀測值相同，所選用模型的擬合效果較好。式中：obs表示實驗觀測值；pred表示模型預測值；n為觀測值個數[28]。

1.4 數據處理與統計分析

2 結果與分析

2.1 不同寡營養條件下20 株Vp的μmax趨勢

本研究測得菌株的μmax值用600 nm波長處OD值變化表示，100%、75%、50%、25%標準TSB+占比條件下菌株的μmax值分別在0.215～0.730、0.149～0.460、0.026～0.178、0.031～0.253 h－1之間，其中Vp2在25%標準TSB+占比條件下μmax值比50%、75%和100%標準TSB+占比大，Vp3在50%標準TSB+占比條件下μmax值比75%和100%標準TSB+占比大，Vp3在75%標準TSB+占比條件下μmax值比100%標準TSB+占比大，Vp4和Vp6在25%標準TSB+占比條件下μmax值比50%標準TSB+占比大，結果見圖1。

由圖1可以看到，Vp1～Vp20號菌株在100%標準TSB+占比條件下的平均μmax值呈現階梯狀增長的趨勢；通過把100%標準TSB+占比條件下20 株不同來源Vp的μmax值作為參考標準，可以發現75%標準TSB+占比條件下μmax值沒有顯著遞增趨勢，50%和25%標準TSB+占比條件下μmax值不遞增趨勢顯著。在100%和75%標準TSB+占比條件下，Vp1菌株μmax值最小，Vp20菌株μmax值最大；在50%標準TSB+占比條件下，Vp4菌株μmax值最小，Vp3菌株μmax值最大，Vp1菌株μmax值處于不同來源20 株Vp菌株μmax平均值中間值偏下，Vp20菌株μmax值處于不同來源20 株Vp菌株μmax平均值中間值偏下上；在25%標準TSB+占比條件下，Vp19菌株μmax值最小，Vp2菌株μmax值最大，Vp1菌株μmax值處于不同來源20 株Vp菌株μmax平均值中間值偏下，Vp20菌株的μmax值處于不同來源20 株Vp菌株μmax平均值中間值偏下。

圖1 20 株不同來源Vp在不同寡營養條件下的μmaxFig.1 Specific growth rate μmax of 20 Vps from different sources under different oligotrophic conditions

本研究與Liu Bingxuan等[25]同類研究Vp的生長異質性進行比較，把100%標準TSB+占比條件下20 株不同來源Vp的μmax值作為參考標準，在Liu Bingxuan等[25]同類研究中選取與本研究相同的Vp菌株進行排序，研究菌株同在100%標準TSB+占比培養基上生長，生長環境均為37 ℃、3% NaCl，但兩者的初始菌液接種量OD值不同，本研究為0.353～0.562之間，Liu Bingxuan等[25]同類研究中為0.073～0.217之間。

如圖2所示，本研究平均μmax值在0.215～0.730 h－1之間，Liu Bingxuan等[25]同類研究中平均μmax值在0.019～0.077 h－1之間。可以發現在100%標準TSB+占比條件下，Liu Bingxuan等[25]同類研究中μmax值沒有顯著的遞增趨勢。在本研究中Vp1菌株的μmax值最小，為0.215 h－1，Vp20菌株μmax值最大，為0.730 h－1；在Liu Bingxuan等[25]同類研究中Vp13菌株的μmax值最小，為0.019 h－1，Vp1菌株的μmax值最大，為0.077 h－1。其中Vp1菌株μmax值最大，為0.077 h－1，處于不同來源20 株Vp菌株平均μmax值最大處，Vp20菌株μmax值為0.03 h－1，處于不同來源20 株Vp菌株平均μmax值中間值附近。

圖2 本研究與同類研究Vp的生長差異比較Fig.2 Comparison between Vp growth observed in the present and previous studies

2.2 不同寡營養條件下20 株Vp的一級模型擬合優度

本研究分別采用修正Gompertz模型、Baranyi模型、Logtistic模型擬合20 株不同來源Vp分別在100%、75%、50%和25%標準TSB+占比培養基上的生長數據，修正Baranyi模型、Logtistic一級模型擬合相關系數R2整體低于0.900，不易選用，修正Gompertz一級模型對20 株不同來源的Vp在不同寡營養條件下的生長數據擬合良好，結果如表1所示。

20 株不同來源Vp分別在100%、75%、50%和25%的標準TSB+占比培養基上的生長數據均可以采用修正Gompertz一級模型進行擬合，且擬合效果良好，修正決定系數R2值區間在0.791～0.997之間，只有Vp2、Vp10菌株在25%標準TSB+占比條件下的修正決定系數R2值在0.918以下，分別為0.791、0.830；75%和50%標準TSB+占比時擬合模型修正決定系數R2值整體比100%和25%標準TSB+占比擬合模型修正決定系數R2值更高。

表1 20 株不同來源Vp在不同寡營養條件下的模型評價參數Table 1 Model evaluation parameters for 20 strains of Vps from different sources under different oligotrophic conditions

續表1

在生長模型擬合優度分析中，平均算術RMSE值靠近0時，表明模型中數據擬合優度更高，越大表明模型的預測值不貼近真實值，本實驗RMSE值在0.012 2～0.149 5之間，其中有5 種條件下RMSE值在0.102以上。Af值表示預測值與觀測值的平均精準度，Bf值表示預測值與觀測值的平均偏差，兩者越靠近1，表明擬合值與觀測值相貼近，表明所選模型良好。本實驗Af、Bf值區間為1±0.070。

2.3 不同寡營養條件下20 株Vp的二級模型生長參數分析

根據修正Gompertz一級模型對20 株不同來源的Vp在不同寡營養條件下的生長擬合，得到20 株不同來源的Vp在不同寡營養條件下的延滯期（λ）、最大比生長速率（μmax）、最大生長密度（ymax），并計算CV，取20 株菌株的生長參數平均值，結果見表2。

表2 20 株不同來源Vp在不同寡營養條件下的動力學生長參數Table 2 Kinetic growth parameters of 20 Vps from different sources under different oligotrophic conditions

Liu Bingxuan等[25]同類研究中在100%標準TSB+占比條件下20 株Vp菌株平均μmax值為0.04 h－1，CV值為38.3%。

由圖3可知，Vp菌株平均λ值隨標準TSB+占比的減少而增大，平均μmax、ymax值隨標準TSB+占比的減少而降低，而代表菌株生長異質性的CV值先隨標準TSB+占比的減少而降低，當標準TSB+占比過低時Vp菌株的生長異質性增高。

圖3 20 株不同來源Vp在不同寡營養條件下λ、μmax、ymax和CV均值二級模型Fig.3 Secondary models fitted to describe delay period (λ), maximum specific growth rate (μmax), maximum growth density (ymax) and CV mean value of 20 strains of Vps from different sources under different oligotrophic conditions

2.4 不同來源對Vp生長異質性的影響

圖4直觀展示了不同寡營養條件下兩類Vp的統計學差異顯著性，淡水與海水Vp顯著性差異通過對應淡水與海水Vp菌株的平均μmax值統計。100%、75%、50%和25%標準TSB+占比條件下其P值分別為0.176、0.145、0.421及0.229，不具有顯著差異。

圖4 不同寡營養條件下20 株淡水與海水Vp的箱線圖Fig.4 Box plot for significant difference between the growth of Vp strains from prawns and shrimps under different oligotrophic conditions

3 討 論

國內外關于Vp的預測模型主要為一級和二級模型，唐曉陽等[28]研究了不同致病性和溫度對Vp μmax的影響，盧曉鳳[29]、Zwietering[30]、楊振泉[31]和田金玲[32]等主要用Gompertz方程擬合菌株的生長曲線，Ma Fengli等[26]、姬華[27]采用3 種一級模型擬合菌株的生長曲線，比較了它們的擬合度。郭丹鳳等[33]研究菌株的延滯期、最大菌濃度等在不同溫度下的異質性。此外，還有關于微生物生長預測的Huang、MMF等一級模型。關于Vp二級預測模型，Yoon[34]、Al-Dagal[35]、Miles[36]等研究了Vp的修正Gompertz生長模型和二級平方根模型；王璐華等[37]探究了Vp的溫度-鹽度雙因素預測模型，二級模型采用平方根模型進行擬合；Nishina等[38]采用二級響應面模型研究了菌株在不同pH值、鹽度和溫度條件下的生長變化；劉代新等[39]采用Design-Expert軟件研究了VpJ33的較優培養條件。選取不同的數字預測[40-44]模型進行擬合，可以得到更準確的實驗結果。

本研究分別采用修正Gompertz模型、Baranyi模型、Logtistic一級模型擬合20 株不同來源Vp分別在100%、75%、50%和25%標準TSB+培養基上的生長數據，修正Baranyi模型、Logtistic一級模型擬合相關系數R2整體低于0.900不易采用，尚未使用Huang、MMF等其他關于微生物生長預測的一級模型和菌株隨標準TSB+占比變化的動態模型。修正Gompertz一級模型對20 株不同來源的Vp在不同寡營養條件下的生長數據擬合良好，綜合分析修正一級Gompertz模型的擬合評價R2、RMSE、Af和Bf值，得到不同Vp菌株在模型擬合的優度上存在一定的差異，這表明預測模型適用于一定條件下的菌株生長預測，選用擬合度高的模型使得實驗結果更具準確性。

二級模型首先用修正Ratkowsky（μmax-N）和Non-linear Arrhenius（λ-N）模型[28]進行擬合，由于擬合系數過低或無法擬合，主要采用生長參數折線圖直觀比較。不同寡營養條件會對菌株λ、μmax、ymax和CV值產生影響，說明不同環境條件下Vp的生長異質性隨著環境不利程度的增高而加大。另本研究中不同來源20 株Vp整體μmax值隨標準TSB+占比的減少而降低，只有Vp2菌株在25%標準TSB+占比條件下μmax值顯著異常，這可能與該營養條件下Vp2菌株生長模型參數的擬合優度低有關。本研究不同來源20 株Vp整體μmax值明顯大于Liu Bingxuan等[25]同類研究，說明相同營養條件下初始菌液接種量不同擬合所得Vp的μmax值也會不同。

由寡營養條件下兩種不同來源Vp的P值可知，不同寡營養條件下兩類Vp的平均μmax值都表現為統計學非顯著性差異。在天然環境下的亞熱帶和溫帶沿海地區的淡水與海水常常屬于寡營養條件，Liu Bingxuan等[25]在自然環境條件下分離自淡水和海水的Vp菌株生長異質性有顯著差異，食源性致病菌的生長異質性影響因素有外部因素和內在因素。外在因素包括pH值、水分活度、溫度、來源等，這表明預測微生物在不同來源的Vp生長異質性需要綜合考慮影響因素。本實驗得出分離自淡水和海水的Vp菌株在同種營養條件下產生了相似的μmax，并且有相對一致的生長異質性。

4 結 論

本研究發現不同寡營養條件會對Vp菌株的λ、μmax、ymax和生長異質性CV值產生較大影響，不同寡營養條件下Vp菌株在模型擬合的優度上存在一定的差異，選擇適合的模型對分析菌株的生長動力學參數準確性至關重要，不同寡營養條件下不同來源Vp菌株平均μmax值均無顯著性差異，補充了李藍天[1]天然海水條件下Vp菌株的生長特性，且得到營養條件一致時，初始菌液接種量也會對菌株生長異質性產生影響。本研究不足之處為未能找到現有的二級生長模型擬合不同寡營養條件會對Vp菌株的λ、μmax、ymax和生長異質性CV值的非線性關系，以及不同寡營養條件下Vp菌株的生長參數動態模型，今后可通過寡營養和富營養條件下Vp菌株大數據生長參數構建不同寡營養條件下二級生長參數模型和動態模型，闡明Vp在寡營養條件下的生長規律，獲得食源性致病菌生長異質性對食品安全風險評估的基礎數據和預測模型，從而更科學地進行食源性致病菌疾病防控。