魚皮明膠和多酚組裝行為與相互作用

王舒雅，趙靖昀，代亞磊，高 瑾，梁宏閃，李述剛，周 彬,3,

（1.湖北工業大學生物工程與食品學院，發酵工程教育部重點實驗室，湖北 武漢 430068；2.華中農業大學食品科學技術學院，湖北 武漢 430070；3.國家外國專家局/教育部“細胞調控與分子藥物”學科創新引智基地（“111”基地），湖北 武漢 430068）

明膠具有優良的乳化性、凝膠性、成膜性、發泡性等性能，在食品和醫藥工業中得到了廣泛的應用[1]。然而，近年來傳統動物明膠在食品中的應用面臨著嚴峻的挑戰。瘋牛病、口蹄疫、禽流感等動物傳染病的頻繁發生，導致了動物源明膠的安全問題[2-3]。因此，開發具有較高生物安全性和接受性的新型明膠成為當前的迫切需要。

隨著中國水產養殖和漁業的迅速發展，水生動物明膠憑借其優良的安全性、低致敏性、低抗原性、高溶解性和易水解性的優點受到科研工作者和企業的關注。多年來，我國水產品產量均居世界第一。水產品加工業每年都會產生大量的魚皮廢料[4-5]，如果不加以有效開發利用，不僅會造成資源的極大浪費，還會造成嚴重的環境污染。然而，目前對魚皮明膠（fish skin gelatin，GLA）的研究多集中于提取工藝的優化，或利用其優異的成膜性制備膜材料等較為單一的研究[6]。因此，研究GLA與食品組分，如多酚、多糖等之間的相互作用及對其功能特性的調控行為，對拓寬其在食品領域的應用具有重要意義。

多酚是廣泛存在于食品體系中的功能性小分子化合物，在食品生產加工及人體消化過程中，植物多酚可通過疏水鍵或氫鍵與多糖、蛋白質等大分子物質發生相互作用，進而影響生物大分子的功能與營養特性，而且多酚可與蛋白質在形成復合物的過程中起交聯作用[7]。且植物多酚憑借其自身的抗氧化、抗炎、抗菌、抗癌、抗病毒等諸多優點，可賦予蛋白、多糖等高分子體系良好的功能特性[8-10]，這對于新型食品添加劑與食品配料的開發具有重要的理論指導意義。

本研究選取不同結構的植物多酚（含有不同數目的鄰多元酚結構），單寧酸（C76H52O46，tannic acid，TA）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（C22H18O11，epigallocatechin gallate，EGCG）、沒食子酸（C6H2(OH)3COOH，gallic acid，GA）[11]為研究對象，系統研究其與GLA間的相互作用及復合行為。3 種不同結構多酚的化學結構式如圖1所示。借助濁度、粒徑和熒光光譜等光學手段及等溫滴定量熱法（isothermal titration calorimetry，ITC），對比研究含有不同數量鄰三元酚結構的多酚與GLA之間的相互作用以及形成復合物的行為。本研究期望提高GLA綜合利用率及其在食品領域的應用范圍，為其開發新型功能食品配料提供數據參考和理論指導，對水產品加工和副產品的利用具有重要意義。

圖1 TA、EGCG、GA的化學結構式Fig.1 Chemical structures of TA, EGCG and GA

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

GLA（A型，200凍力，巴沙魚皮中提?。?上海燁熠生物科技有限公司；TA、EGCG、GA 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；所用其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

TCM-1000穩態熒光光譜儀 美國新澤西州國際光子技術有限公司；自動ITC 200等溫滴定量熱儀、Zetasizer Nano-ZS 90納米粒度測定儀 英國馬爾文公司；722s可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；Seven Compact精密pH計 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 透光率測定

稱取適量的明膠加入0.01 mol/L磷酸鹽緩沖溶液中，在50 ℃水浴中磁力攪拌30 min，配制10 mg/mL明膠溶液[12]。隨后，在磁力攪拌條件下將多酚溶液（TA、EGCG、GA溶液濃度分別為20、40 mmol/L和40 mmol/L）加入明膠溶液中，得到膠體復合物溶液。用分光光度計測定其在波長500 nm處的透光率。

1.3.2 粒徑

采用Zetasizer Nano-ZS 90激光納米粒度儀測定膠體復合物的粒徑大小與分布情況。

1.3.3 熒光光譜分析

參照Joye等[13]的方法，熒光測量用穩態熒光光譜儀進行測量。熒光實驗在恒溫條件下進行，恒溫水浴溫度分別為298 K和308 K，恒溫12 min后，立即掃描溶液的熒光光譜。實驗參數：熒光燈功率75 W、激發波長280 nm、采集發射信號300～400 nm、步階2 nm。

1.3.4 ITC

采用自動ITC 200等溫滴定量熱儀分析TA、EGCG、GA與GLA結合的熱力學過程。分別配制10 mg/mL的GLA溶液、1 mmol/L的TA溶液、10 mmol/L的EGCG溶液、20 mmol/L的GA溶液，避光保存在4 ℃冰箱中備用。參比室注入去離子水作為熱平衡對照，用微量注射器將GLA溶液緩慢注入到樣品池中，避免產生氣泡，若有氣泡需將氣泡排除。注射器中注入TA溶液（或EGCG、GA溶液），分20 次單獨注射將多酚溶液注入至樣品池中，每滴5 μL，攪拌速率為250 r/min，溫度設置為298 K[14]。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 多酚溶液對復合體系透明度的影響

多酚和蛋白質可通過疏水相互作用、氫鍵等作用力自組裝形成各種聚集體或微納結構[15]?？疾於喾?GLA比例對體系透明度的影響，由圖2可知，隨著多酚添加量的增加（尤其是TA和EGCG體系），多酚-GLA復合溶液由最初的無色透明逐漸呈現出微藍色乳光。微藍色乳光的出現說明隨著多酚的添加，體系中的GLA和多酚通過相互作用逐步組裝為微納結構。且隨著體系中多酚含量的增加，微藍色乳光愈發明顯，說明GLA與多酚形成的微納組裝體的數量、粒徑均發生了一定的變化。對比分析3 種多酚對體系透明度的影響規律發現，TA濃度為0.2 mmol/L時即出現微藍色乳光。且隨著TA添加量的進一步增加，體系透明度顯著下降。而EGCG體系中透明度下降較為緩慢，在多酚濃度約為0.8 mmol/L時才出現肉眼可見的渾濁現象。對于GA體系而言，隨著GA添加量的增加，混合溶液的透明度并未出現顯著下降，均呈現澄清透明的狀態。究其原因是蛋白質與多酚之間可通過氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等形成復合物。如明膠分子中含有氨基、羧基和羥基等基團可以與多酚結構的酚羥基發生非共價相互作用，在明膠分子之間形成網狀結構，最終在低濃度下形成分散的納米復合物[16]。而明膠與多酚形成復合物的程度取決于多酚的分子質量，分子質量越小，酚羥基的數目越少，與明膠發生碰撞時，結合能力越弱[17]。就本研究中的3 種多酚而言，TA含有大量酚羥基，且其結構類似5 個懸臂，并具有一定的柔性，可看作是一種多位點的交聯劑，可與不同明膠分子或同一明膠分子的不同位點結合，更易形成蛋白-多酚復合物。EGCG相比于TA，其酚羥基較少，雖亦可作為交聯劑，但交聯作用弱于TA。而GA只含有一個苯環，其上相鄰含有3 個酚羥基，該結構整體剛性較強，導致3 個酚羥基不能像TA和EGCG一樣容易與明膠分子作用，且位阻作用也阻礙了GA分子與不同的明膠分子發生作用。推測GA分子更傾向吸附于單個明膠分子上，故不易于產生交聯作用形成復合物。

圖2 GLA溶液中添加不同濃度的TA（A）、EGCG（B）和GA（C）對透明度的影響Fig.2 Influence of concentration of TA (A), EGCG (B) and GA (C) on the transmittance

2.2 pH值和循環次數對溶液體系可逆性的影響

反應體系的pH值顯著影響多酚和蛋白質的聚集行為，不同多酚與蛋白質都有它們最適合的pH值絡合點[18]。蛋白質可以在其等電點上下進行質子化和去質子化轉變，所以體系pH值對多酚與GLA復合物的形成具有顯著影響。本研究通過調節多酚-GLA復合溶液的pH值以考察pH值對二者相互作用的影響規律。如圖3A所示，EGCGGLA體系隨著pH值的增加其透光率逐漸下降，在達到pH 6.5左右時趨于平穩。而TA-GLA體系在pH值約為5.5時達到最小值之后，隨著pH值的進一步升高，體系透光率呈現出回升的趨勢。A型巴沙魚GLA的等電點在7～9之間[19]，可能是TA與GLA之間較強的相互作用使二者形成復合物，TA上大量的酚羥基和羰基使復合物等電點向低pH值方向移動。由圖3A可知，在低于復合物等電點時，體系pH值升高逐漸逼近復合物的等電點時，斥力減小，多酚-GLA復合物間的聚合動力大于其間的阻力，更加容易聚集形成聚集體，導致體系透明度下降。而高于復合物等電點后，逐漸遠離等電點使體系靜電斥力逐漸增大，減少了物質碰撞形成聚集體的幾率，故而在遠離等電點時透光率又逐步回升。而EGCG-GLA間的相互作用弱于TA-GLA，且其負電性亦相對較弱，所以pH值對EGCG-GLA體系的透明率影響程度也相對較小。通過反復調節pH值發現，TA-GLA和EGCG-GLA體系中多酚與GLA的組裝行為表現出穩定的可逆性（圖3B、C），顯示這2 種體系具有良好的pH值響應性。

圖3 TA-GLA和EGCG-GLA復合物的透光率隨pH值（A）和循環次數（B、C）的變化Fig.3 Transmittance of TA-GLA and EGCG-GLA complexes as a function of pH (A) and cycle number (B and C)

2.3 pH值對多酚-GLA復合物粒徑的影響

由于GA和GLA體系未形成蛋白-多酚復合物，故只探討pH值對TA-GLA和EGCG-GLA復合物粒徑的影響規律。由圖4可知，在pH 4.5、5.5和6.8時TA-GLA和EGCGGLA粒徑均呈現單峰分布，且粒徑分布較窄。在相同pH值條件下，TA-GLA復合物比EGCG-GLA復合物的粒徑更大，這是由于TA與GLA之間具有更多的結合位點，更易形成復合物且粒徑相對較大。然而，當pH 7.4時，TAGLA和EGCG-GLA復合物粒徑均呈現雙峰。這可能是由于pH值的增加導致二者所帶電荷的變化，且較高的pH值會破壞氫鍵相互作用，進而導致復合物的不均一性。

圖4 pH值對TA-GLA（A）和EGCG-GLA（B）粒徑分布的影響Fig.4 Particle size distribution of TA-GLA (A) and EGCG-GLA (B)complexes at different pH

2.4 多酚對GLA熒光光譜的影響

2.4.1 熒光光譜分析

蛋白質分子中的芳香族氨基酸殘基、色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸，能夠在一定波長光源的激發下發射熒光，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基因為生色基團不同而分別在348、303 nm和282 nm波長處出現熒光峰。由于蛋白質分子中苯丙氨酸殘基的熒光極弱且易被猝滅，熒光的產生主要是酪氨酸和色氨酸[20]。在280 nm激發波長下，GLA的最大發射波長為304 nm，且在348 nm波長處未見熒光峰出現，且A型巴沙魚GLA中幾乎不含色氨酸，酪氨酸含量為1.61%[21]，故本研究主要觀察酪氨酸熒光信息的變化。

固定GLA質量濃度，變化TA、EGCG和GA濃度，在300～400 nm范圍內掃描熒光發射光譜。由圖5可知，在298 K和308 K條件下，隨著TA、EGCG和GA溶液添加量的增加，GLA發射峰的熒光強度呈現持續下降趨勢，說明多酚與GLA之間發生相互作用，使GLA的內源熒光規律性下降。對比分析3 種多酚對GLA內源熒光的猝滅行為，發現3 種多酚對GLA的熒光猝滅能力為TA＞EGCG＞GA。結果表明，TA比EGCG、GA更多地使處于疏水環境中酪氨酸暴露，導致GLA熒光強度的減弱。同時，GLA的最大發射波長發生微弱紅移。研究表明，蛋白質分子最大熒光發射波長的變化，在一定程度上能夠反映蛋白質分子中熒光發色基團本身及其周圍環境的變化[22]，多酚的加入使GLA熒光發射峰產生位移，說明酪氨酸殘基的親水性增強，其肽鏈的伸展程度也有所增加，導致最大發射波長的變化[23]。多酚使GLA中更多的酪氨酸殘基暴露，肽鏈更加舒展，導致最大發射波長向長波方向移動。

圖5 多酚濃度變化的熒光發射掃描光譜圖Fig.5 Fluorescence emission scanning spectra with varying polyphenol concentration

2.4.2 猝滅類型的確定

多酚等物質與蛋白結合的熒光猝滅機理主要分為動態猝滅和靜態猝滅，二者的主要區別是對溫度和黏度的依賴性不同[24]。靜態猝滅是指多酚與GLA形成無熒光或弱熒光的復合物而導致的，猝滅常數隨著溫度的升高而降低；而動態猝滅是多酚和蛋白質分子之間相互碰撞引起的，猝滅常數隨著溫度升高而增大。分析多酚等物質和蛋白質的熒光猝滅機制時采用Stern-Volmer方程[25]：

式中：F0、F分別為單寧酸等多酚猝滅劑加入前后的熒光強度；[Q]為單寧酸等猝滅劑濃度/（mol/L）；Ksv、Kq分別為猝滅常數和猝滅速率常數；τ0為猝滅劑不存在時生物大分子的平均壽命，生物大分子的平均壽命約為10－8s。

圖6 TA-GLA（A）、EGCG-GLA（B）和GA/GLA（C）相互作用的Stern-Volmer曲線Fig.6 Stern-Volmer curves for TA-GLA (A), EGCG-GLA (B) and GA/GLA (C) interaction

如圖6所示，根據數據繪制Stern-Volmer曲線，計算Ksv和Kq數據（表1），在多酚作用范圍內曲線都具有良好的線性關系。由表1可知，隨著處理溫度的升高，Ksv值卻隨之下降，說明3 種多酚和GLA相互作用的猝滅機制可能均為靜態猝滅而不是動態猝滅。另外，各類猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數為2.0×1010L/（mol?s），而多酚對GLA的動態猝滅速率常數Kq的數量級達到了1012～1013，即便是GA組也接近1012L/（mol?s），遠高于猝滅劑對生物大分子的最大擴散碰撞猝滅常數。這些結果進一步證實了TA、EGCG、GA對GLA的熒光猝滅機制是靜態猝滅。其中Ksv和Kq為TA＞EGCG＞GA。因為TA具有最多的酚羥基及苯環結構，且分子柔性較高，容易與酪氨酸結合形成弱熒光物質，導致GLA熒光猝滅最為嚴重，而GA的酚羥基與苯環結構最少，對GLA熒光猝滅能力最弱。

表1 不同溫度下多酚與GLA相互作用的Stern-Volmer猝滅常數Table 1Stern-Volmer quenching constants for interactions between polyphenols and GLA at different temperatures

2.4.3 多酚與GLA的結合常數及結合位點數

圖7 TA-GLA（A）、EGCG-GLA（B）和GA/GLA（C）相互作用的雙對數曲線Fig.7 Double logarithmic curves for TA-GLA (A), EGCG-GLA (B) and GA/GLA (C) interaction

對于靜態猝滅，TA、EGCG和GA與GLA的結合常數可由方程[26]（2）確定：

繪制雙對數曲線如圖7所示，y軸的截距可以得到結合常數K的信息，斜率表示可用的結合位點數n。結果見表2，3 種多酚與GLA的結合位點數都接近于1，隨著溫度的升高，結合位點數增加，表明升高溫度，有助于多酚和GLA發生相互作用。通過比較結合常數K的值，發現TA與GLA的結合常數顯著大于EGCG和GA，GA與GLA的結合常數最小，說明多酚和GLA的結合作用強弱為TA＞EGCG＞GA。

表2 多酚-明膠復合物的表觀結合常數、結合位點數及線性相關系數Table 2 Apparent binding constants, binding site numbers and correlation coefficients for polyphenol-GLA complexes

2.5 ITC結果

ITC能夠直接測定出2 種物質相互作用的熱力學參數，如結合焓（ΔH）、結合熵（ΔS）等信息（表3）。對于作用力類型的判斷，研究表明：當ΔH＞0、ΔS＞0時，主要作用力為疏水作用力；當ΔH＜0、ΔS＞0時，靜電作用力起主要作用；當ΔH＜0、ΔS＜0時，氫鍵和范德華力起主要作用[27]。

表3 多酚（TA、EGCG）與GLA蛋白相互作用的熱力學參數Table 3 Thermodynamic parameters for interaction between polyphenols and GLA

如圖8所示，圖上半部分為原始數據，縱坐標表示補償加熱絲補償給樣品池和參與池的熱量速率差。圖下半部分為積分結果，縱坐標表示每次滴加產生的熱流差對時間的積分。TA與GLA相互作用的反應熱為負值導致峰向下[28]，說明二者的結合過程是放熱反應。反應熱ΔH值最大，表明二者發生相互作用時放熱最多，相互作用力最強，同時還發現結合常數值最大進一步證明TA和GLA的相互作用最強[29]。ΔG為負值表明TA和GLA的反應是自發進行的，反應的熵值為負值，說明GLA與TA之間的相互作用為熵驅使，氫鍵和范德華力在反應中起主要作用。

圖8 TA（A）、EGCG（B）、GA（C）與GLA相互作用的等溫滴定量熱圖Fig.8 Isothermal titration calorimetry plots for interaction of TA (A),EGCG (B) and GA (C) with GLA

在EGCG-GLA相互作用中可以看出，結合常數K和ΔH絕對值均小于TA-GLA，說明EGCG與GLA的結合能力低于TA與GLA的結合能力，放出的熱量少于TA。有研究報道明膠與多酚的結合能力與多酚的分子質量有關系，分子質量越小，酚羥基數量越少，與明膠的結合能力就越弱[30]，TA的摩爾質量（1 701.20 g/mol）大于EGCG（458.37 g/mol），因此GLA與TA的結合強于與EGCG的結合。另外，GLA與EGCG的ΔG為負值，表明明膠與EGCG之間的相互作用也可自發進行。熵值為正值，表明EGCG與GLA是焓驅使[31]，觀察熵值和焓值可以得出靜電作用是主要結合力。對于GA-GLA體系，不斷增加GA濃度仍不能在ITC測試中使二者反應熱達到平衡，不能擬合出合理的相關熱力學參數，故GA-GLA體系的相關參數未在此列出。

3 結 論

本研究通過濁度和粒徑分析、光譜學（熒光光譜）和熱力學（ITC）手段探究不同結構的多酚與GLA之間的相互作用。結果顯示，在一定濃度下，TA和EGCG均可以和GLA發生相互作用形成納米復合物，導致溶液體系透明度的變化，而GA雖也可與GLA發生相互作用，但不能產生宏觀上濁度的明顯變化。其中TA與GLA形成復合物的能力最強。且TA和EGCG與GLA形成的納米復合物可以隨著pH值的變化實現可逆沉降。通過熒光光譜法和ITC得出，3 種多酚和GLA均可以形成弱熒光的復合物，猝滅類型為靜態猝滅；TA、EGCG和明膠的作用均是可自發進行的放熱反應，氫鍵和范德華力是TA-GLA相互作用的主要結合力，靜電作用是EGCG-GLA相互作用的主要結合力，這為多酚明膠膠體配合物的制備提供了重要信息，對GLA和多酚的利用具有重要意義。