利用基質輔助激光解吸電離質譜成像技術研究斑馬魚響應富營養化污染水質內源性脂質分子變化

張雅文，秦 亮，陳路路，王曉東,2*

(1.中央民族大學生命與環境科學學院,北京 100081；2.生物成像與系統生物學研究中心，北京 100081)

水體富營養化是水中氮、磷等營養物質含量積累過多而引起的一種水質污染現象[1-3]。在水體富營養化情況下，藻類的快速繁殖往往致使水體透明度下降，顯著影響其他水生植物光合作用效率，易造成水中溶解氧的異常，進而導致水生生物大量死亡[4-5]。水體富營養化不僅影響人類飲用、農田灌溉、畜牧養殖的用水質量，而且也容易造成水體生態系統功能失衡[4，6]。已有研究報道，隨著降水類型變化和化學肥料的廣泛應用，預計在中國東部可能會出現更嚴重的富營養化現象[7]。考慮到未來水質污染變化，在水資源短缺的形勢下監測富營養化情況，構建生態環保、綠色、高效的水質污染檢驗、監測和評價方法至關重要。水生生物與水體環境之間具有直接交互影響的特點，水生生物的生理生化變化一定程度上可以直接反應水質環境的變化情況。因此，從生理學角度上，利用對于水環境變化敏感的水生生物研究其響應富營養化污染水質時內源性分子變化規律對于探究并建立新型、綠色、高效水體質量監測方法與分析策略具有現實意義。

斑馬魚(Zebrafish)屬于鯉科魚丹屬脊椎動物，由于其個體較小(成熟體長4～6 cm)，繁殖周期短，對外源分子處理具有敏感性，并且其基因與人類高度相似(相似度高達到 87%)，因而常被作為一種模式物種應用于諸多研究領域，例如生物學、基礎醫學、藥學、神經科學等[8-11]。許多研究表明斑馬魚對于外源污染物具有明顯的生物富集效應，因此其也被廣泛應用于環境科學研究，如常被用于農藥、化學肥料、重金屬污染水質的監測與評估[12-14]。截至目前，盡管基于斑馬魚開展的污染水質毒理學研究取得了眾多進展[15-16]，但是仍缺乏斑馬魚應對水質污染時其內源性脂質分子變化規律的研究。眾所周知，生物體內的脂質分子在信號轉導、質膜組成、物質運輸及能量儲存等諸多方面均發揮重要作用。研究表明脂質代謝失衡與生物體應對外界環境脅迫密切相關[17-18]。因此，準確、全面、系統地獲取斑馬魚響應富營養化水質污染時體內關鍵脂質分子變化及原位空間分布信息，對于進一步理解該物種應對外界富營養化水質污染脅迫時的脂質分子響應機制至關重要。目前用于研究生物體內脂質分子常用方法主要包括系統溶劑分離技術[19]、薄層色譜(thin-layer chromatography,TLC)[20]、核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)[21]、氣相色譜-質譜聯用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)[22-23]、液相色譜-質譜聯用(liquid chromatography-MS,LC-MS)[24-26]等。通常情況下，為了保證這些方法對于脂質分子的有效分析效能，首先需要完成對生物樣品中內源性脂質分子的分離提取。然而，這些分離提取方法復雜而煩瑣的操作程序，不可避免地增加了脂質分子結構改變的風險(如體外氧化)[27]，而且無法獲得生物體響應生物與非生物脅迫時內源性脂質分子變化的原位信息。顯然，對于生物組織內部脂質分子真實結構特征及原位分布情況的全面、直觀解讀對于深刻理解生物體內源性脂質分子應對環境脅迫作用機制至關重要。質譜成像(MS imaging,MSI)作為一種新型分子影像技術，可在整體、組織或細胞水平上同時表征樣本表面多種分子組成、結構、豐度及原位空間分布信息[28-30]。近年來，隨著該技術的不斷發展與完善，已被廣泛應用于基礎醫學、藥物學、微生物學、動植物科學等諸多前沿研究領域[31-33]。

現運用新型基質輔助激光解吸電離質譜成像(matrix assisted laser desorption ionization MS Imaging,MALDI-MSI)技術，從生物內源性脂質代謝分子角度出發，針對環境敏感型模式物種斑馬魚應對富營養化污染水質脅迫后內源性脂質分子表達與分布的變化進行整體動物原位研究，以期初步揭示富營養化污染水質斑馬魚脂質分子響應機制，為水體質量監測與評價新型分析策略的建立奠定實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

質譜純甲醇(methanol)、甲酸(formic acid,FA)、乙醇(C2H5OH)、硫酸(H2SO4)、硝酸(HNO3)、高氯酸(HClO4)、抗壞血酸(C6H8O6)、鉬酸銨(H8MoN2O4)、氫氧化鈉(NaOH)、過硫酸鉀(K2S2O8)、鹽酸(HCl)、硝酸鉀(KNO3)、三氯甲烷(CHCl3)、高錳酸鉀(KMnO4)、草酸鈉(C2Na2O4)、磷酸二氫鉀(KH2PO4)、碳酸鎂(MgCO3)、酚酞(phenolphthalein)、丙酮(acetone)、2-巰基苯并噻唑(2-mercaptobenzothiazole,2-MBT)均購于Sigma-Aldrich公司；peptide standard II標準溶液購于德國Bruker Daltonics公司；實驗用水為超純水(Milli-Q H2O,美國Millipore公司)。

基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜儀(Autoflex Speed MALDI time-of-fight(TOF)/TOF mass spectrometer)購于德國Bruker Daltonics公司，該儀器配備Nd:YAG脈沖式紫外激光器(激光波長為355 nm)；銦氧化錫(indium tin oxide,ITO)包被導電載玻片及基質噴涂裝置(ImagePrep)均購于德國Bruker Daltonics公司；徠卡CM1860冷凍切片機購于德國Leica Microsystems公司；電子天平購于瑞士Mettler Toledo公司；Thermo Mixer C混勻儀購于德國Eppendorf公司；愛普生V-550平板掃描儀購于美國Epson公司等。

1.2 富營養化水體體系模擬

1.2.1 富營養化水體材料

為使實驗模擬更符合實際，實驗結果更具有代表意義，供試水取自北京某大學一小型湖泊(116° 19′0.14″E，40° 0′2.38″N)中部水層。利用有機玻璃采水器采集水面20 cm以下的水樣，獲得后去除水中明顯雜物，避光保存。同時為保證水樣富營養化程度，使用抓斗式采泥器采集湖塘表層10 cm厚的底泥。

1.2.2 水體富營養化程度測試

確認供試水的富營養化程度。按照相關性、可操作性、簡潔性和科學性相結合的原則，從影響湖泊富營養化的眾多因子中選取總氮(total nitrogen,TN)、總磷(total phosphorus,TP)、葉綠素a(chlorophyll a,Chl.a)、透明度(transparency,SD)、高錳酸鹽指數(chemical oxygen demand of Mn,CODMn)共5項指標作為富營養化評價的統一指標。利用綜合營養指數法(comprehensive trophic level index,TLI)對供試水的富營養化程度進行評價。

根據GB11894—89，使用堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法測定水中總氮質量濃度；根據GB11893—89，使用鉬酸銨分光光度法測定水中總磷質量濃度；根據GB11892—89，使用重鉻酸鹽法測定水中高錳酸鹽質量濃度；根據《水和廢水監測分析方法》第四版，使用塞氏盤法測定透明度，使用分光光度法測定葉綠素a含量。

綜合營養狀態指數公式為

式中：TLI(∑)為綜合營養狀態指數；TLI(j)為第j種參數的營養狀態指數；Wj為第j種參數的營養狀態指數的相關權重；m為評價參數個數。采用0～100的一系列連續數字對營養狀態進行分級：綜合營養狀態指數 ≤30為貧營養；30＜綜合營養狀態指數≤50為中營養；綜合營養狀態指數>50為富營養；50＜綜合營養狀態指數≤6為輕度富營養化；60＜綜合營養狀態指數≤70為中度富營養化；綜合營養狀態指數>70為重度富營養化。

1.3 斑馬魚實驗樣本收集與培養

成年斑馬魚購于北京花鳥市場，魚齡120 d左右，平均體長為(3.5±0.5)cm。正式實驗前將其在水溫(26±1)℃，pH為7.5±0.5，光照周期14 h，光照/10 h黑暗條件下進行馴化飼養14 d。每天喂食豐年蟲(Artemia nauplii)2次，糞便和未食用的食物每天清理一次；每天置換50%培養水體。在馴養期間，所有斑馬魚健康，死亡率＜2%。

取實驗組和對照組水缸，長×寬×高規格為40 cm×30 cm×25 cm，有效水深16.5 cm。實驗組水缸注入供試富營養化水，對照組水缸只注入正常無污染水。根據經濟合作與發展組織(Organization for Economic Co-operation and Development,OECD)測試準則，在滿足實驗樣本基本數量(n>7)和水缸大小的前提下，分別將30條成年斑馬魚在實驗組與對照組水缸中暴露96 h，并在24 h、48 h、72 h和96 h記錄斑馬魚的死亡率。

1.4 MALDI MS實驗樣本前處理

實驗組與對照組分別培養96 h后，選取兩組的斑馬魚(均體長約4.5 cm)置于模具中，放入-80 ℃冷凍致死6 h，然后開展質譜成像實驗。具體實驗步驟如下：首先用徠卡CM1860冷凍切片機對其進行低溫切片，取連續組織切片(厚度為10 μm)轉移至ITO導電玻片導電面，在室溫下干燥15 min；然后對相應組織切片進行形態掃描以獲得高清光學組織圖像，用以后續質譜成像采集區域矯正與標定；隨后將基質化合物2-MBT 溶于混合MeOH/H2O/FA(80∶18∶2,v/v/v)溶液中，最終配置成2-MBT濃度為 12 mg/mL的基質溶液；進而將該溶液導入至基質噴涂裝置ImagePrep完成對組織切片40個周期的基質噴涂(每個周期包括：2 s噴霧，30 s孵育，60 s干燥時間)。在進入質譜儀器分析前，對基質包被的組織切片進行二次干燥處理，待干燥充分后裝靶導入質譜進行數據采集。

1.5 質譜成像及數據處理

質譜成像采用基質輔助激光解吸電離飛行時間串聯質譜儀(MALDI-TOF/TOF MS,德國Bruker Daltonics公司)，以正離子反射模式獲得數據。成像分辨率為100 μm，激光能量強度為80%，設定數據采集的質量范圍為m/z500～1 000，并使用peptide standard II標準溶液(德國Bruker Daltonics公司)進行質量校準。通過Bruker MALDI-TOF/TOF MS碰撞誘導解離(collision-induced dissociation,CID)離子碎裂方式采集MS/MS數據(碰撞誘導碎裂能量設置為19 keV)，將檢測到代謝物的特征片段離子，與數據庫中一級和二級代謝物進行匹配鑒定。數據處理采用FlexAnalysis軟件(v.3.4版本,德國Bruker Daltonics公司)對MALDI-MS數據進行查看和處理等，成像數據使用FlexImaging軟件(v.4.1版本,德國Bruker Daltonics公司)對質譜成像數據進行重構。

在MetaboAnalyst 4.0平臺(https://www.metaboanalyst.ca/)上對采集的質譜數據進行主成分分析(principal component analysis,PCA)和偏最小二乘回歸分析(partial least squares discrimination analysis,PLS-DA)，以確定對照組和實驗組是否具有統計學差異。通過與代謝物數據庫METLIN(https://metlin.scripps.edu/)和LIPID MAPS(https://www.lipidmaps.org/)匹配一級和二級信息鑒定代謝物(ppm＜10，ppm表示百萬分率，ppm=|(實際分子量-理論分子量)|/理論分子量×106)。在正離子模式下數據庫匹配時，囊括了以下三種加合離子形式：[M+H]+、[M+Na]+及[M+K]+進行檢索。

2 結果與討論

2.1 水質營養狀態評價

通過測量總氮、總磷、葉綠素a、透明度、高錳酸鹽指數指標，并利用綜合營養指數法(TLI)對供試水的富營養化程度進行評價。結果如表1所示，供試水的綜合營養指數為57.14，經過與分級標準進行對比，確定供試水的營養程度為輕度富營養化。

2.2 富營養化水質影響斑馬魚代謝差異分析

斑馬魚經過富營養化污染水質脅迫96 h后，利用MALDI-MS技術，在相同條件下對實驗組(隨機選取3條，n=3)與對照組(隨機選取3條，n=3)斑馬魚體內代謝物進行總體分子輪廓檢測，其中實驗組共檢測到106個信號峰，對照組48個信號峰。如圖1所示，富營養化水質處理組與未處理組斑馬魚對比發現有超過50%原位檢測的代謝分子存在顯著表達差異。進一步對實驗組與對照組分子信號數據進行t檢驗(Student’sttest)，分析發現實驗組與對照組數據具有極顯著差異(p＜0.000 1)。實驗結果表明，富營養水質對斑馬魚造成脅迫，導致斑馬魚體內代謝急劇變化，相關代謝分子種類及含量的變化與斑馬魚響應脅迫機制密切相關。

為了進一步避免本實驗結果的偶然性，將實驗組和對照組平行檢測個體實驗從3條增加至9條。即，實驗組在富營養化水質處理96 h后的30條斑馬魚中隨機選取9條(體長約4.5 cm)，對照組在未處理組的30條斑馬魚隨機選取9條(體長約4.5 cm)進行平行對比MALDI-MS實驗。結果如圖2(a)所示，相關性分析揭示實驗組與對照組斑馬魚內源性分子間存在明顯差異，實驗組組內相關性相對較弱，對照組組內相關性相對較強。該結果表明：斑馬魚在應對富營養化脅迫時個體間存在一定主成分1差異，但并不影響區分組間差異。利用無監督主成分分析(principal components analysis,PCA)和有監督偏最小二乘回歸分析法(partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)對富營養化污染水質脅迫斑馬魚和對照組MALDI-MS數據進行統計分析。PCA得分圖顯示在主成分1(the first principal component，PC1)(98.7%)和主成分2(the second principal component，PC2)(0.9%)軸上，富營養化水質實驗組和對照組之間存在明顯的分離。如圖2(b)(PCA)、圖2(c)(PLS-DA)所示，對照組組內分布較為集中，而實驗組組內分布較為離散，說明未處理組斑馬魚個體之間內源性分子表達差異較小，而暴露在富營養化水質96 h后斑馬魚個體之間代謝分子表達差異較大。實驗結果充分表明實驗組斑馬魚個體之間內源性分子表達較大的離散度與其生活的富營養化水質條件密切相關。因此，可以猜測其中的原因可能是由于富營養水質脅迫下斑馬魚個體間出現了一定的代謝異常從而增大了個體間代謝水平的異質性，進而出現了在相同脅迫條件下不同個體之間的響應情況和程度的差異性。盡管如此，兩種統計學分析方法均能將實驗組與對照組明顯的分成兩簇，足以說明富營養化污染水質脅迫實驗組斑馬魚與未處理組斑馬魚體內內源性化合物存在顯著表達差異。

表1 實驗組水質富營養化情況統計表Table 1 Evaluation of eutrophication for experimental group water

實驗組：富營養化水質培養的斑馬魚；對照組：正常水質培養的斑馬魚；****為極顯著差異；p＜0.000 1圖1 斑馬魚內源性代謝分子MALDI-MS原位正離子模式檢測及t檢驗分析Fig.1 Comparison of metabolites in-situ detected in zebrafishes fed in eutrophication water and normal water by MALDI-TOF/TOF MS in positive ion mode and t-testing

皮爾遜相關系數(PCC)為1時表示變量完全正相關，0時表示無關，-1時表示完全負相關；主成分(PC1)是方差最大的變量的線性組合(在所有線性組合中),其解釋了數據中盡可能多的變化;主成分2(PC2)盡可能多地解釋剩余的變化，其約束條件是第一個和第二個成分之間的相關性為0。PC1和PC2的累積貢獻率越大表示斑馬魚實驗組與對照組代謝組差異越大圖2 斑馬魚實驗組與對照組代謝差異分析Fig.2 Difference analysis of metabolites in zebrafishes between eutrophication group and control group

為了進一步探究主要差異代謝分子的變化及其功能作用，利用PLS-DA進行變量投影重要性(variable importance of projection,VIP)分析(化合物VIP值越大，其對于區分各組樣品的貢獻度越大)篩選用于區分實驗組與對照組斑馬魚貢獻度大代謝分子，并對VIP值排名靠前的主要代謝化合物(VIP>1)進行鑒定分析，具體結果如表2所示?？梢园l現，一共分析篩選出了10種差異代謝分子，鑒定結果表明，這些分子主要屬于磷脂酰膽堿(phosphatidylcholines,PCs)及磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamines,PEs)兩類磷脂類化合物，具體分子類型如下：PC(32∶0)、PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(36∶0)、PC(38∶6)、PC(40∶6)、PE(36∶8)、PE(36∶0)、PE(38∶0)、PE(40∶9)。磷脂是生物膜的重要組成成分，作為膜的結構和功能單位，磷脂以其規律的結構保證細胞的正常形態和功能，如生長、繁殖、細胞識別與消除、細胞間信息傳遞、細胞防御、能量轉換等功能[34-35]。因此在富營養化水質中暴露96 h后斑馬魚體內磷脂表達水平的變化可能是為了應對富營養化水質對機體的不利影響，而發生的自我適應反應。

2.3 富營養化水質影響斑馬魚內源性脂質分子原位表征分析

現利用MALDI-MSI原位分析實驗組與對照組斑馬魚體內脂質代謝分子的變化信息，更直接地觀察富營養化污染水質對斑馬魚內源性代謝物的影響。在正離子檢測模式下，重構了富營養化水質培養的斑馬魚和未處理組斑馬魚體內主要脂質代謝物原位的質譜成像圖，如圖3所示，質譜成像信號主要由磷脂類組成，顏色越鮮亮表示相應磷脂在該檢測部位的相對含量越高。對比整體斑馬魚質譜成像圖發現不同的磷脂類代謝物在斑馬魚整體組織切片上的分布具有明顯組織特異性。根據已鑒定出的斑馬魚中的磷脂類物質在組織切片中質譜成像顏色亮度的深淺，可知斑馬魚體內的磷脂含量總體上實驗組高于對照組，且在斑馬魚切片各部分呈現出明顯的組織特異性分布差異。因此，在富營養化水質的脅迫下，環境中更多的N、P營養元素容易進入斑馬魚體內從而影響起其體內脂質代謝情況，一定程度上可以改變體內磷脂類化合物的表達水平。此外，富營養化造成的水質條件的改變，如溶解氧的下降，也會對斑馬魚體內正常代謝造成影響。

表2 富營養化水質脅迫下斑馬魚與正常對照組相比主要差異脂質分子鑒定信息(VIP>1)Table 2 Identification of differential lipids(VIP>1)detected in zebrafishes fed in eutrophication water and normal water by MALDI-TOF/TOF MS in positive ion mode

PC為磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine),PE為磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine)圖3 實驗組與對照組斑馬魚主要差異脂質分子質譜成像圖Fig.3 Images of differential lipids(VIP>1)detected in zebrafishes fed in eutrophication water and normal water by MALDI-TOF/TOF MS in positive ion mode

磷脂酰膽堿(PCs)廣泛存在于動物體內，是磷脂類分子主要成分之一，生物體多種生理生化代謝活動均與其密切相關。研究表明PCs的積累有助于有促進神經傳導、提高腦部信號交互活力、增強機體抗病變及抗氧化能力、活化血管降低血脂、延緩機體衰老及改善膜磷脂組分增加膜流動性和膜酶活性等[36-41]。富營養化脅迫的斑馬魚與正常水質斑馬魚體內主要差異PCs分子質譜成像結果如圖3所示?？梢园l現實驗組斑馬魚體內差異PCs分子表達水平明顯高于對照組，表明斑馬魚受到富營養化脅迫時體內磷脂酰膽堿代謝出現了異常，推測與其應對外界刺激、維護機體正常生命活動有關。這些主要差異PCs分子具體組織特異性分布情況如下：PC(34∶1)主要集中在頭部、眼部及軀干背部分布，實驗組該磷脂分子的表達量明顯高于對照組，推測該分子的高表達可能與提高機體活力及反應力有關。PC(40∶6)主要集中在魚眼位置分布，其中實驗組中該分子集中分布在魚眼外周，而在對照組中則集中分布在魚眼內部區域，暗示該磷脂分子的這種互補差異分布與斑馬魚眼睛感知周圍水生環境變化密切相關，顯然富營養化水體濁度明顯高于正常水體，且兩組水體之間水中所含物質組成也有明顯不同，在一定程度上會引起水體滲透壓的改變；因此可以推測PC(40∶6)分子的差異表達與斑馬魚眼部器官應對外界環境的變化存在一定相關性。PC(32∶0)在實驗組中主要分布在魚鰓及腹腔區域，而在對照組中則集中分布在腹腔及魚尾與魚身交界區域；PC(38∶6)在實驗組中集中在魚鰓、腹腔及軀干背部尾部區域高表達；此外，PC(34∶2)與PC(36∶0)在實驗組與對照組中具有類似的分布情況，主要集中在斑馬魚軀干區域分布，兩組之間最大區別在于兩種磷脂分子表達量實驗組明顯高于對照組。魚鰓是魚類與水環境進行物質交換的重要樞紐之一，在魚類免疫力異常情況下，環境中的有害物質易通過該器官進入斑馬魚體內，進而影響其眾多生理生化活動。PCs在魚鰓和靠近魚鰓附近區域的積累，說明應對富營養化水質時，斑馬魚積累更多的PCs可能與改善、活化魚鰓生物學功能有關[42]。腹腔PCs分子的差異表達可以一定程度上反映斑馬魚應對富營養化污染時腹腔生理活動能力的改變。軀干部分是魚類綜合活動正常執行的主要載體，本研究發現短時間水體富營養化脅迫并沒有造成斑馬魚活動能力的明顯異常；因此，斑馬魚軀干區域PCs分子的差異表達在一定程度上與斑馬魚應對富營養化脅迫、抵御不利影響存在相關性，也進一步證明了PCs分子的積累有助于提高生物體抗病變能力[43]，與之相關的精確分子作用機制仍需進一步研究。

磷脂酰乙醇胺(PEs)是一類廣泛存在于生物體中且含量僅次于PCs的磷脂分子，是合成其他甘油磷脂類分子的重要中間體，并且研究表明PEs在細胞自噬、細胞分裂、蛋白質折疊、蛋白質修飾前體的合成等多種生命活動中均發揮著重要作用[44-45]。例如，MALDI-MSI成像圖3所示，PE(36∶8)、PE(36∶0)、PE(38∶0)及PE(40∶9)在富營養化水質處理的斑馬魚中分子表達明顯上調且其分布的組織特異性較上述差異PCs分子要低，表明同種PE分子可能參與了眾多組織或器官的多種生理生化活動，一定程度上證明了PEs分子具有多樣的生物學功能[46-47]?；诒緦嶒灥难芯拷Y果可以推測當富營養化水質對斑馬魚機體產生脅迫時，體內不同區域PEs的積累可能與斑馬魚自身細胞損傷修復或凋亡、錯誤折疊蛋白降解、受損細胞器清理等生理生化過程密切相關。在未來的研究中將開展更多的實驗，以期進一步揭示PEs分子在斑馬魚響應富營養化脅迫時精確分子作用機制。

已有研究表明水體富營養化會嚴重影響魚類體內的代謝過程[4]，研究結果進一步證明了這一結論，實驗結果表明斑馬魚受富營養化水質影響其體內的代謝分子(特別是磷脂分子)會出現不同程度異常表達。有研究表明，氮、磷等營養因子在低濃度時可作為水體中魚類的餌料資源，一定程度上可形成魚類的生存有利環境，從而有助于提高魚類產量[48-49]。然而，當這些營養元素濃度超過一定限度時容易誘發水體富營養化污染，從而使得這些營養成分成為了水生生物生存負面環境因子的誘因，比如水中過高的N、P元素濃度容易促使喜氧浮游生物的過度繁殖，而進一步造成水體溶解氧含量的顯著下降、水中氨含量超標等[50]。水環境中的氨增加，抑制了魚類自身氨的排出，使血液和組織中氨的濃度升高，容易引起魚類直接中毒并出現呼吸困難、分泌物增多等一系列生理反應；水中溶解氧的降低，易造成魚類呼吸成本的上升，而引起魚類異常的生理生化反應。然而對于魚類應對水體富營養化污染時出現的上述多種生理生化異?，F象一直缺少分子層面的直觀可視化研究，本文實驗的開展一定程度上彌補了這一不足，MALDI-MSI結果直接證明了斑馬魚體內脂質分子在應對水體富營養化脅迫時存在明顯異常表達。有研究表明：水體中有機磷含量過多的情況下，魚類生物的膽堿酯酶容易發生磷酸化，形成穩定的磷酸化膽堿酯酶，從而導致膽堿代謝紊亂[51-52]。本文研究實驗組成像結果所示，暴露在富營養化水質96 h后，斑馬魚體內的PCs在體內不同部位積累，一定程度上表明富營養化水質造成了斑馬魚體內一定的膽堿代謝紊亂，而這些磷脂酰膽堿分子組織特異性積累一定程度上說明，斑馬魚試圖提高膽堿的PCs供應源用以弱化膽堿生成量的異常，從而試圖維持斑馬魚正常生理活動。

水體中的污染物質積累容易導致水生生物體內脂質分子過氧化(lipid peroxidation,LPO)進而影響正常的生理活動和機體健康[53]，LPO是評估氧化應激的最常用方法之一[54]。水生生態系統中富營養化誘導的生物體氧化應激反應，可以顯著影響水生生物的免疫能力，如降低機體抵御外援抗原的能力、增強對蠕蟲等病原體的過度敏感性等，進而影響魚類等生物的健康。在對墨西哥熱帶河流中水生生物的研究結果顯示水體含磷化合物與水生生物脂過氧化應激水平相關[55]。本文研究發現脂質分子在富營養化水質脅迫斑馬魚體內不同程度的積累情況可能與斑馬魚應對體內脂質分子過氧化應激反應相關。盡管對于精確解讀斑馬魚響應富營養化污染水質環境分子機理還需更多的研究進一步探索，但是本文研究初步證實了富營養化水質確實可以通過影響水生生物的生理生化過程(例如富營養化水質會造成斑馬魚體內脂質代謝過程的改變)，進而影響水生生物在水體中的正常生理活動行為。因此本文研究對于斑馬魚應對富營養化水質脅迫時體內脂質分子特異質性分布信息的揭示為進一步探究該模式物種體內脂質代謝分子機制奠定了初步實驗基礎。

3 結論

將新型質譜成像技術MALDI-MSI應用到水生脊椎模式動物斑馬魚中，以探索其響應富營養化污染水質內源性脂質分子變化規律。結果顯示富營養化水質脅迫的斑馬魚體內PC(32∶0)、PC(34∶1)、PC(34∶2)、PC(36∶0)、PC(38∶6)、PC(40∶6)、PE(36∶8)、PE(36∶0)、PE(38∶0)、PE(40∶9)共10種脂類分子表達發生了顯著變化，MALDI-MSI原位表征直觀地展示了這些脂類分子在斑馬魚體內的異質性分布情況，為斑馬魚響應富營養化污染水質分子機制的揭示提供了新的見解。盡管以上實驗結果直接證明了斑馬魚應對富營養化水質脅迫時其體內脂質分子代謝確實出現了明顯變化，但也需要更多的研究用以精確揭示該水生模式物種響應富營養化污染水質相關脂質代謝分子應對機制。

綜上所述，本文研究為揭示斑馬魚響應富營養化污染水質脂質代謝分子變化規律奠定了實驗基礎，并進一步證實了MALDI-MSI技術作為一種新型分子影像方法在利用水生生物監測、評估水質環境研究中具有良好的潛在應用前景，可為未來水生生物生態生理學評估提供新的研究策略。