微小RNA-744-5p靶向整合素連接激酶對膀胱癌細胞增殖、遷移、侵襲的影響

張躍，孫彥申

膀胱癌是泌尿系統常見的惡性腫瘤，具有較高的發病率和死亡率。膀胱癌的生物學特征較為復雜，具有多發灶、易復發和轉移等特征。復發和轉移是膀胱癌病人治療失敗和死亡的主要原因。目前，膀胱癌的發病機制尚不清楚，研究其發病機制并尋找新的有效治療靶點十分有必要。miR-744-5p是微小RNA（miRNA）家族成員，參與多種疾病發展進程。劉紅軍等用miRNA 芯片檢測姜黃素對膀胱癌細胞miRNA 表達圖譜的影響時發現，姜黃素可上調膀胱癌細胞中miR-744-5p 表達。然而，miR-744-5p 對膀胱癌細胞惡性表型的影響還未知。生物信息學軟件預測顯示，miR-744-5p 可能靶向調控ILK 表達。整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）是哺乳動物細胞中的主要信號傳導分子，參與調控腫瘤細胞惡性表型。研究顯示，膀胱癌組織中ILK 表達升高，且ILK 高表達與膀胱癌病理分化程度密切相關，檢測ILK 水平有助于膀胱癌的臨床診斷與預后，沉默ILK 基因表達可阻礙膀胱癌細胞增殖、侵襲及上皮間質轉化（EMT）。本研究主要探討了miR-744-5p 對膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響以及其是否通過調控ILK表達發揮作用。

1 材料與方法

1.1 組織樣本

選取2016 年2 月至2018 年11 月本院接收的56 例經病理切片確診的膀胱癌病人的癌組織和對應的癌旁組織。其中男性31 例，女性25例，年齡36～71 歲，平均年齡（52.29±6.71）歲。所有病人均未接受任何治療，如放療、化療等。病人或其近親屬知曉本研究，并簽署知情同意書。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》的相關要求。

1.2 細胞和實驗試劑

膀胱癌BIU-87、T739 細胞，中國科學院上海細胞庫；胎牛血清（FBS），杭州四季青；RPMI 1640 培養基，美國 Hyclone 公司；Lipofectamine2000 試劑盒，美國 Invitrogen 公司；四氮唑藍（MTT），美國 Sigma 公司；miR-744-5p mimcs、miR-NC、anti-miR-744-5p、anti-miR-NC、ILK 的小干擾RNA（si-ILK）及陰性對照si-NC、ILK 過表達載體（pcDNA3.1-ILK）及空載體pcDNA3.1，上海吉瑪公司；Trizol 試劑、逆轉錄試劑盒和PCR 試劑盒，大連寶生物；鼠抗人細胞周期蛋白（Cyclin D1）、P21、ILK單克隆抗體，美國Santa Cruz 公司；鼠抗人基質金屬蛋白酶（MMP-2）和鈣黏附蛋白E（E-cadherin）單克隆抗體，福州邁新生物技術有限公司；雙熒光素酶活性檢測試劑盒，威格拉斯生物技術（北京）有限公司。

1.3 方法

1.3.1

細胞培養及轉染 復蘇BIU-87、T739 細胞，均用含10%FBS 的RPMI1640 培養基培養。取對數期BIU-87、T739細胞，均接種于6孔板中（1.0×10個/孔），培養24 h 后，更換為不含血清的RPMI 1640 培養基。利用LiPofectamine2000 脂質體轉染法，將miR-744-5p mimcs（miR-744-5p 組）、anti-miR-744-5p（anti-miR-744-5p 組）、si-ILK（si-ILK 組）、miR-NC（miR-NC 組）、anti-miR-NC（anti-miR-NC 組）、si-NC（si-NC 組）、miR-744-5p mimcs 與 pcDNA3.1-ILK（miR-744-5p+pcDNA-ILK 組）、miR-744-5p mimcs 與pcDNA3.1（miR-744-5p+pcDNA 組）分別轉染至BIU-87、T739 細胞。轉染12 h 后，更換新鮮培養基。再培養24 h 后，實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測細胞中miR-744-5p、蛋白質印跡法（Western Blotting）檢測細胞中ILK 蛋白表達驗證轉染效果，并收集細胞用于后續實驗。

1.3.2

qRT-PCR 檢測 miR-744-5p 表達 用 Trizol試劑提取組織或細胞中總RNA，逆轉錄為cDNA 后，行PCR擴增。引物序列miR-744-5p正向5′-CTGTTGCCACTAACCTCAACCT-3′，反向 5′-TGCGGGGCTAGGGCTAACAGCA-3′；U6 正向 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向 5′-A ACGCTTCACGA ATTTGCGT-3′。用2法計算組織或細胞中miR-744-5p相對U6的表達量。

1.3.3

細胞增殖實驗 將各組轉染后的BIU-87、T739 細胞均接種于96 孔板中（1.0×10個/孔），培養24、48、72 h 后，加 20 μL MTT（5 g/L）。孵育 4 h 后，棄培養基，加150 μL 二甲基亞砜，混合均勻，酶標儀490 nm處測OD值。實驗重復3次。

1.3.4

Transwell 實驗 將各組轉染后的BIU-87、T739細胞用不含不含FBS的RPMI 1640培養基調整密度為2.5×10個/mL。遷移實驗：取100μL 細胞懸液加至 Transwell 上室，500μL 含 10 %FBS 的 RPMI 1640 培養基加至下室。培養24 h 后，棄培養基，取出小室，用甲醛固定、結晶紫染色后，用顯微鏡觀察，計數。侵襲實驗：預先在Transwell 上室鋪Matrigel基質膠，自然晾干后，再加100μL細胞懸液，后續步驟同遷移實驗。

1.3.5

Western Blotting 法檢測蛋白表達 將各組轉染后的 BIU-87 細胞均接種于 6 孔板中（1.0×10個/孔），培養48 h 后，用RIPA 試劑提取細胞中總蛋白，BCA 法測蛋白濃度。然后行12%SDS-PAGE 電泳、轉膜及5%脫脂牛奶中封閉1 h 后，在4 ℃并箱中分別 用 Cyclin D1（1∶500）、P21（1∶500）、MMP-2（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）和 GAPDH 一抗孵育過夜。洗膜后，再于37 ℃搖床中用山羊抗兔二抗（1∶2 000）孵育2 h。加入顯影液，避光顯影后，凝膠成像系統曝光拍照，Image J 軟件分析目的蛋白相對GAPDH的表達量。

1.3.6

雙熒光素酶報告基因實驗 根據miR-744-5p 與 ILK 的 3’UTR 序列的結合位點，合成 ILK 目的基因；同時將結合位點突變，合成ILK 突變基因。以pGL3 為載體，Xho I 和 Kpn I 為插入位點，獲得 ILK基因野生型質粒WT-ILK 及突變型質粒MUT-ILK。取對數期 BIU-87、T739 細胞接種于24 孔板中（2.5×10個/孔），培養 24 h 后，棄培養基。利用 Lipofectamine2000 試 劑 盒 ，將 WT-ILK 與 miR-744-5p mimics 或 miR-NC、MUT-ILK 與 miR-744-5p mimics或miR-NC+ pGL3-MUT-ILK 分別共轉染至BIU-87、T739 細胞。轉染12 h 后，更換新鮮的培養基。再培養24 h后，裂解細胞，離心（3 500 r/min、5 min）后，取上清液，檢測熒光素酶活性，結果以螢火蟲與海腎的熒光強度比較表示。

2 結果

2.1 miR

-

744

-

5p 在癌旁組織和膀胱癌組織中的表達

癌旁組織、膀胱癌組織中miR-744-5p 的表達水平分別為（0.98±0.10）、（0.25±0.02），兩者比較差異有統計學意義（

t

=21.475，

P

＜0.05）。

2.2 過表達miR

-

744

-

5p或抑制miR

-

744

-

5p表達對BIU

-

87、T739細胞增殖的影響

轉染miR-NC、miR-744-5p mimics 的 BIU-87 細 胞中 miR-744-5p 表 達 水平分別為（1.09±0.11）、（3.11±0.31），T739 細胞中miR-744-5p 表達水平分別為（1.02±0.10）、（2.56±0.26），兩者比較差異有統計學意義（

t

=18.423，

P

＜0.05；

t

=16.585，

P

＜0.05），表明 miR-744-5p mimics 轉染成功，過表達 miR-744-5p 的 BIU-87、T739 細胞構建成功。miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細胞 OD 值和Cyclin D1 蛋白表達低于miR-NC 組（

P

＜0.05），而P21蛋白表達高于 miR-NC 組（

P

＜0.05）。見圖 1，表1，表2。

表1 過表達miR-744-5p對BIU-87細胞增殖的影響/

表2 過表達miR-744-5p對T739細胞增殖的影響/

圖1 過表達miR-744-5p對BIU-87、T739細胞增殖蛋白表達的影響：A為過表達miR-744-5p對BIU-87細胞增殖蛋白表達的影響；B為過表達miR-744-5p對T739細胞增殖蛋白表達的影響

轉 染 anti-miR-NC、anti-miR-744-5p mimics 的BIU-87 細胞中 miR-744-5p 表達水平分別為（1.03±0.10）、（0.35±0.03），T739 細胞中 miR-744-5p 表達水平分別為（1.01±0.11）、（0.31±0.04），兩者比較差異有 統 計 學 意 義（

t

=19.540，

P

＜0.05；

t

=17.942，

P

＜0.05），表明 anti-miR-744-5p 轉染成功，抑制 miR-744-5p 的 BIU-87、T739 細胞構建成功。anti-miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細 胞 細 胞 OD 值 高 于 antimiR-NC組（

P

＜0.05）。見表3。

表3 抑制miR-744-5p對BIU-87、T739細胞增殖的影響/

2.3 過表達miR

-

744

-

5p或抑制miR

-

744

-

5p表達對BIU

-

87、T739 細胞遷移和侵襲的影響

miR-744-5p組 BIU-87、T739 細胞的遷移數、侵襲數和 MMP-2 蛋白表達低于miR-NC 組（

P

＜0.05），而E-cadherin 蛋白表達高于miR-NC組（

P

＜0.05）。見圖2，表4，表5。

表4 過表達miR-744-5p對BIU-87細胞遷移和侵襲的影響/

表5 過表達miR-744-5p對T739細胞遷移和侵襲的影響/

圖2 過表達miR-744-5p對BIU-87、T739細胞遷移、侵襲蛋白表達的影響：A為過表達miR-744-5p對BIU-87細胞遷移和侵襲蛋白表達的影響；B為過表達miR-744-5p對T739細胞遷移和侵襲蛋白表達的影響

anti-miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細胞遷移數、侵襲數升高于anti-miR-NC組（

P

＜0.05）。見表6。

表6 抑制miR-744-5p對BIU-87、T739細胞遷移、侵襲的影響/

2.4 miR

-

744

-

5p 靶向調控ILK 的表達

生物信息學軟件顯示的 ILK 的 3’UTR 與 miR-744-5p 的互補序列見圖3A。共轉染miR-744-5p 與WT-ILK 的BIU-87、T739 細胞熒光素酶活性低于共轉染miRNC 與 WT-ILK 的 BIU-87、T739 細胞（

P

＜0.05），而共轉染 miR-744-5p 與 MUT-ILK 的 BIU-87、T739 細胞熒光素酶活性與共轉染miR-NC 與MUT-ILK 的BIU-87、T739 細胞比較差異無統計學意義，說明miR-744-5p 在 BIU-87、T739 細胞中可與 ILK 的 3’UTR 靶向結合。與 miR-NC 組相比，miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細胞 ILK 蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05）；antimiR-NC 組相比，anti-miR-744-5p 組 BIU-87、T739 細胞ILK 蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），說明miR-744-5p靶向結合并負調控ILK。見圖3，表7，表8。

表7 雙熒光素酶報告實驗/

表8 miR-744-5p調控BIU-87、T739細胞中ILK蛋白表達/

圖3 miR-744-5p靶向調控ILK：A為ILK的3’UTR含有miR-744-5p的互補序列；B為miR-744-5p對BIU-87細胞ILK蛋白表達的影響；C為miR-744-5p對T739細胞ILK蛋白表達的影響

2.5 過表達ILK 逆轉了miR

-

744

-

5p 對BIU

-

87、T739 細胞增殖、遷移和侵襲的影響

miR-744-5p+pcDNA3.1-ILK 組 BIU-87、T739 細胞 OD 值、遷移數、侵襲數及Cyclin D1 和MMP-2 蛋白表達高于miR-744-5p+pcDNA3.1 組（

P

＜0.05），但 P21 和 E-cadherin蛋白表達低于miR-744-5p+pcDNA3.1 組（

P

＜0.05）。見圖4，表9～12。

圖4 過表達ILK能逆轉miR-744-5p對BIU-87、T739細胞增殖、遷移、侵襲蛋白表達的影響：A為過表達ILK逆轉miR-744-5p對BIU-87細胞增殖、遷移和侵襲蛋白表達的影響；B為過表達ILK逆轉miR-744-5p對T739細胞增殖、遷移和侵襲蛋白表達的影響

表9 過表達ILK逆轉miR-744-5p對BIU-87細胞增殖的影響/

表10 過表達ILK逆轉miR-744-5p對T739細胞增殖的影響/

表11 過表達ILK逆轉miR-744-5p對BIU-87細胞遷移和侵襲的影響/

表12 過表達ILK逆轉miR-744-5p對T739細胞遷移和侵襲的影響/

3 討論

miRNA 是一類小分子單鏈非編碼RNA，其可通過調控靶基因的表達影響細胞的生物學行為，參與腫瘤發生和發展。研究顯示，miR-744-5p 在卵巢癌細胞系中表達降低，通過直接靶向HNRNPC 和NFIX 誘導卵巢癌細胞凋亡。miR-744-5p 參與調節乳腺浸潤性微乳頭狀癌（IMPC）對紫杉醇的耐藥性，可作為IMPC 的分子標志物。高表達miR-744-5p 可通過靶向抑制UBE2L3 的表達抑制前列腺癌細胞增殖，遷移，侵襲等惡性表型，其在前列腺癌中發揮抑癌基因作用。目前，miR-744-5p 對膀胱癌的影響還未知。本研究結果顯示，膀胱癌組織中miR-744-5p 呈低表達，膀胱癌 BIU-87、T739 細胞轉染miR-744-5p mimics 后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力降低，而轉染miR-744-5p 抑制劑后，細胞的增殖、遷移和侵襲能力提高，表明miR-744-5p 在膀胱癌組織中活性喪失，恢復癌細胞中miR-744-5p 表達可降低癌細胞的惡性生物學行為，提示miR-744-5p作為抑癌基因參與膀胱癌的發生和發展，其活性喪失可能是導致膀胱癌發生和發展的因素之一，有希望成為膀胱癌治療的分子靶點。

為了進一步探究miR-744-5p 抑制膀胱癌細胞惡性表型的分子機制，本研究證實了miR-744-5p 可靶向結合并負調控ILK。ILK 是細胞內具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的信號蛋白，參與調控腫瘤的發生和發展。研究顯示，沉默ILK 表達可抑制胰腺癌、人舌癌等腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，而過表達ILK 可促進胃癌、肺癌等腫瘤細胞的增殖和遷移。這說明ILK 可能在不同腫瘤中發揮的作用。膀胱癌組織中ILK 表達升高，聯合檢測ILK 與AKT、β-catenin 有助于判斷膀胱癌的惡性程度。本研究結果顯示，過表達ILK 可有效降低過表達miR-744-5p 對膀胱癌 BIU-87、T739 細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用，這進一步提示miR-744-5p 可能通過靶向抑制ILK 的表達來阻礙膀胱癌細胞增殖、遷移和侵襲。