長鏈非編碼RNA TPT1-AS1在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義

賀伯偉，王鵬國

肺癌是最常見的癌癥，其中85%的病人為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），據統計，經手術治療后約40%NSCLC 病人，會因癌細胞轉移復發或死亡，嚴重危害人們身體健康。因此，找尋與NSCLC 疾病進展密切相關的生物標志物，是尋找新型靶向藥物的基礎。近來研究發現轉錄生成的RNA，只有2%左右序列進行編碼蛋白質，其它的稱均不編碼蛋白稱為非編碼RNA。非編碼RNA分為長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）和小非編碼RNA（small non-coding RNA，sncRNA），lncRNA 與腫瘤細胞的增殖、凋亡密切相關。研究發現，lncRNA 異常表達與乳腺癌、胃癌、腎細胞癌等多種腫瘤發生發展密切相關。已有研究發現，lncRNA TPT1-AS1在腦膠質瘤、肝癌中有重要的作用，但在非小細胞肺癌少有報道，本研究通過觀察TPT1-AS1 在非小細胞肺癌中的表達，分析其與臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2014 年 7 月至 2016 年 9 月陜西省核工業二一五醫院非小細胞肺癌病人，手術切除非小細胞癌組織100 例、癌旁肺組織100 例。病人男性 65 例，女性 35 例，年齡（54.70±6.21）歲。納入標準：（1）經診斷確診為非小細胞肺癌病人；（2）所選病人術前未進行過化療和放療；（3）病人生存期不小于3 個月，排除標準：（1）無明確的病灶；（2）患有嚴重心腦血管疾病的病人；（3）患有精神障礙疾病的病人。樣本在－80 ℃冰箱保存。所有病人均簽訂知情同意書。術后對所有病人進行隨訪，統計病人生存情況，以病人死亡為終點事件，隨訪截止時間2019 年2 月。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 試劑及儀器

PrimeScript RT reagent Kit（貨號RR047A）購 自 日 本 TAKARA 公 司 ；AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（貨號Q111-02）購自南京諾唯贊生物科技有限公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒（貨號P0010S）購自上海碧云天公司；TRizol試劑（貨號TR118-100）購自上海素爾生物科技有限公司；酶標儀（型號Multiskan GO）、超低溫冰箱（型號MDFU32V）購自美國 Thermo 公司；Real time-PCR 所需引物由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3 方法

定量聚合酶鏈反應（qPCR）：（1）提取組織RNA：取100 mg肺癌組織及癌旁組織于試管內然后加1 mL Trizol，用研磨器在冰上研磨45 s 制備組織勻漿液，加入氯仿和異丙醇提取RNA，加20～50 μL RNase-free 水溶解完全后，測濃度。按照Prime-Script RT reagent Kit 說明書進行逆轉錄操作，體系為10 μL，在冰盒上進行操作。實時熒光定量逆轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）體系按照試劑盒說明書進行配制，總體積20 μL，每個樣本設置3 個重復，GAPDH 為內參，PCR 反應條件：預變性：95 ℃，30 s，40 個循環，95 ℃，10 s，60 ℃，20 s，延伸：70 ℃，10 s，反應結束后，TPT1-AS1 相對表達量用 2計算，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

2 結果

2.1 lncRNA TPT1

-

AS1 在非小細胞肺癌中的相對表達

經qRT-PCR 檢測后，與癌旁肺組織相比，非小細胞肺癌組織中TPT1-AS1 表達水平顯著升高［（2.18±0.16）比（0.91±0.12），

t=

63.500，

P

＜0.05］。

2.2 lncRNA TPT1

-

AS1 的表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

100 例非小細胞肺癌病人按照lncRNA TPT1-AS1 平均表達水平將非小細胞肺癌組分為lncRNA TPT1-AS1 高表達組59 例和低表達組41 例，分析lncRNA TPT1-AS1 在非小細胞肺癌病人中的表達與臨床病理特征的關系結果表明，lncRNA TPT1-AS1 在非小細胞肺癌病人組織中的表達與淋巴轉移、TNM 分期有關（

P

＜0.05），與病人的性別、年齡、腫瘤大小、病理類型、分化程度無關（

P

＞0.05）。見表2。

表2 TPT1-AS1的表達與非小細胞肺癌臨床病理特征的關系

2.3 lncRNATPT1

-

AS1 表達對病人生存關系的影響

lncRNATPT1-AS1 高表達組 NSCLC 病人 3 年存活率為10.17%，lncRNATPT1-AS1 低表達組NSCLC病人3 年存活率為41.46%，log-rank 檢驗顯示，與lncRNA TPT1-AS1 低表達組相比，高表達者生存率顯著降低（

χ

=13.376，

P

＜0.001）。

2.4 預后影響因素分析

單因素分析顯示，lncRNATPT1-AS1表達、TNM 分期、淋巴轉移是非小細胞肺癌病人預后的危險因素。多因素分析顯示，lncRNATPT1-AS1 表達和TNM 分期是影響非小細胞肺癌病人預后的獨立危險因素（HR=1.954，95%

CI

為1.545～2.473，

P

＜0.05；HR=2.013，95%

CI

為1.591～2.547，

P

＜0.05）。見表3。

表3 影響非小細胞肺癌病人預后的危險因素分析結果

3 討論

肺癌主要分為非小細胞肺癌（NSCLC）和小細胞肺癌（SCLC），其中NSCLC 是肺癌中發病率最高，根據其病理學形態和臨床特征可以分為：腺癌、鱗癌、大細胞癌等。近年來，常規化學療法和放射療法已取得較好發展，是肺癌病人治療的重要手段，NSCLC 發生受多種基因的調控，目前其發病機制尚不明了。因此，加強分子水平研究NSCLC 發生發展相關因子，尋找新的治療靶點有利于NSCLC 的診治及預后。

長鏈非編碼RNA（lncRNA）是長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA，缺少完整功能性的開放閱讀框，水平表達低，無蛋白編碼能力，但可以通過與RNA 結合蛋白互作，調控其靶基因啟動子，還可在轉錄或轉錄后調控基因表達。Schmitz 等研究報道lncRNA 在基因控制發育和分化以及人類疾病中發揮多中功能，Zhang 等研究發現，lncRNATUG1 通常在非小細胞肺癌（NSCLC）組織中被下調，TUG1 敲低促進體外和體內的腫瘤細胞增殖。Chen等研究發現，lncRNA HULC 在多種腫瘤中的預后效果密切相關。Liu 等研究發現，lncRNA XLOC的異位表達促進胃癌細胞活力，遷移和侵襲，導致轉移加速，而lncRNA XLOC 表達降低則阻礙細胞遷移和侵襲。Jiang 等發現，通過調控 LncRNA EGFR 表達，可以促進Treg 細胞分化。綜上所述，異常的lncRNA 在各種生物學過程中發揮關鍵作用，包括細胞分化，增殖，凋亡，遷移，侵襲等。目前，大量研究結果表明，多種lncRNA 在肺癌中起著抑制或促進的調控作用。本研究發現，lncRNA TPT1-AS1在NSCLC 的癌組織中的表達顯著高于癌旁組織，提示lncRNA TPT1-AS1可能在NSCLC中是促癌因子。

Lu 等研究表明，LncRNA AFAP1-AS1 在肝細胞癌和肝內膽管癌中表達均上調，與癌癥的惡化程度及預后密切相關。本研究結果與此類似：lncRNA TPT1-AS1 表達與NSCLC 病人臨床病理學特征的相關性，結果顯示，lncRNA TPT1-AS1 在 NSCLC 癌組織相對表達量與淋巴轉移、TNM 分期顯著相關，提示lncRNA TPT1-AS1 的表達可能與NSCLC 的發生發展過程相關。通過對研究組生存相關分析，發現lncRNA TPT1-AS1 高表達組病人生存率顯著降低于lncRNATPT1-AS1 低表達組NSCLC 病人，進一步多因素分析結果顯示，lncRNA TPT1-AS1 表達和TNM分期是影響NSCLC 病人預后的獨立危險因素，提示lncRNA TPT1-AS1 表 達 和 TNM 分 期 與 NSCLC 病 人預后密切相關，可能通過檢測lncRNA TPT1-AS1 表達監測NSCLC病人病情發展，評估病人預后。

綜上所述，研究 lncRNA TPT1-AS1 在 NSCLC 病人癌組織中高表達，與NSCLC 的發生發展相關，對NSCLC 病人預后評估有一定的指導意義。由于本研究臨床樣本的數量和地域有局限性，需要擴大樣本，并且需要進一步研究lncRNA TPT1-AS1 的分子作用機制，為NSCLC 的早期篩查和預后判斷提高更多的理論依據。