微小RNA-338-3p靶向調控高遷移率族蛋白B1增強子宮內膜癌對紫杉醇敏感性的研究

鄒學紅，汪俊，王芳，謝環

子宮內膜癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率呈逐年上升趨勢，但關于子宮內膜癌的發病機制仍不明確。有研究發現紫杉醇（paclitaxel，PTX）可抑制乳腺癌等腫瘤細胞，PTX 可聯合順鉑用于子宮內膜癌的治療。有多項研究表明miRNAs 可影響癌細胞對PTX 藥物敏感性，如miRNA-101 增強乳腺癌MDA-MB-231 細胞對PTX 的藥物敏感性。有報道稱 miR-338-3p 可靶向 FOXP4 抑制肝癌細胞的增殖，miR-338-3p 通過調控 ZEB2 和MACC1 信號通路影響胃癌細胞上皮間質轉化，但關于miR-338-3p 在子宮內膜癌的表達相關研究仍較少。有研究發現高遷移率蛋白B1（high-mobilitygroupboxprotein-1，HMGB1）在子宮內膜癌中表達上調，發揮促癌基因作用。但 miR-338-3p 是否通過調控HMGB1 表達增強子宮內膜癌對PTX 的敏感性仍未可知。本研究自2019年1-6月通過流式細胞術和CCK-8 實驗，探討miR-338-3p 調控人子宮內膜癌細胞HEC-1B 和ishikawa 對PTX 敏感性的影響分子機制，為深入探討人子宮內膜癌發病和耐藥機制以及改善子宮內膜癌患者的預后提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器

DMEM 培養基（C11965500BT）、青霉素和鏈霉素（15140122）為美國Gibco 公司產品；ECL 試劑（P0018）、RIPA 蛋白裂解液（P0013B）、HMGB1 抗體（AF1174）和蛋白印跡法（Western blottingting）所用試劑為碧云天公司產品；β-肌動蛋白（β-actin）為德國Merck 公司產品（A4700）；Trizol 試劑為英濰捷基公司產品（15596026）；CCK-8 試劑盒（CA1210）為索萊寶公司產品；mirPremiemicro RNA Isolation Kit（SNC50）為德國 Merck 公司產品；一步法miRNA反轉錄試劑盒（D1801）為新?；蚬井a品；mirVana實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRTPCR）miRNA detection Kit（AM1558）為賽默飛公司產品；雙熒光素酶報告基因質粒（E1751）為美國Promega 公 司 產 品 ；Annexin V-FITC/PI 檢 測 試 劑（CA1020）、CCK8 試劑盒（CA1210）為北京 Solarbio公司產品；PTX（33069-62-4，純度≥98%）為成都德銳可生物科技有限公司；實驗中所用引物、質粒均由江蘇金唯智公司合成制備。

1.2 方法

1.2.1

細胞培養及轉染 人子宮內膜癌細胞株Ishikawa 細胞株由中國人民解放軍武漢總醫院醫院婦產科實驗室保存，人正常子宮內膜上皮細胞ESC和子宮內膜癌細胞株HEC-1B 購于北京細胞中心，細胞培養于含有10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素和100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 培養基中，在 37 ℃、5%二氧化碳及飽和濕度培養箱中培養；將細胞分為如下5組：miR-338-3p組（轉染miR-338-3p mimics組）、miR-NC（轉染miRNA陰性對照組）、si-HMGB1組（轉染干擾RNA）、si-NC 組（轉染siRNA 陰性對照）和miR-338-3p+HMGB1 組（共轉染 miR-338-3pmimics和pcDNA3.0 HMGB1 組），將各組用轉染試劑轉染至 Ishikawa 和 HEC-1B 細胞，培養 6 h 后更換為完全培養基用于后續實驗。

1.2.2

Ishikawa 和 HEC-1B 細 胞 PTX 敏 感 性 的 檢測 將上述轉染組細胞接種至96孔板中，細胞密度為 8×10個/mL，24 h 后，各孔加入相應濃度的 PTX（終濃度分別為 0 、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL）繼續培養24 h 后，棄去培養基，加入完全培養基100 μL 和10 μL CCK-8溶液繼續培養1 h，按照1.2.4 中方法檢測細胞增殖，并計算細胞存活分數，繪制擬合曲線。

1.2.3

RT-qPCR 檢測 miR-338-3p mRNA 水平 采用 TRIZOL 法提取細胞總 RNA，mirPremiemicro RNA Isolation Kit 分離miRNA，利用一步法miRNA反轉錄試劑盒進行反轉錄，用mirVanaqRT-PCR miRNA detection 試劑盒進行RT-qPCR 檢測，以U6為內參，2法檢測 miR-338-3p mRNA 水平，步驟參照各試劑盒方法。MiRNA-338-3p（退火溫度為60 ℃）的SRT 引物：TCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAAT-TCAGTTGAGCAACAA；特異性性引物：AUGACUCAGGCGACTCCAGC-ATCAGTGATT；通用引物：TGGTGTCGTGGAGTCG；U6（退火溫度為58 ℃）引 物 ：F：GCGGTCTGCGCGATCAAG，R：TTCCCCTCGAGCTCATTGCC。

1.2.4

CCK-8 法檢測細胞增殖 將上述處理組細胞消化后接種至96 孔板中，每孔100 μL，每孔細胞為 6×10個，每組設置 5 個復孔，待細胞培養 0 、24、48、72 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續培養1 h，在酶標儀選擇450 nm 波長，測定并記錄各孔吸光度值（OD），實驗重復3 次，求平均值，繪制細胞增殖曲線。

1.2.5

雙熒光素酶報告基因實驗 采用TargetScan預測HMGB1 可能是miR-338-3p 的靶基因。分別將含有與 miR-338-3p 結合位點的 HMGB1 3’UTR 片段及突變體插入到pGL3 熒光報告載體基因下游，分別記為HMGB1-WT（野生型）和HMGB1-Mut（突變型）。將測序鑒定正確的HMGB1-WT 和HMGB1-Mut 質粒分別與 miR-NC 和 miR-338-3p mimics 共轉染 Ishikawa 和 HEC-1B 細胞，常規培養 24 h 后，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書步驟進行檢測。

1.2.6

Annexin V-FITC/PI 檢測細胞凋亡 收集上述處理組細胞，用胰蛋白酶將細胞消化，取1×10個細胞，加入 300 μL 的 DMEM 重懸細胞，加入 5 μL Annexin V-FITC，室溫避光孵育 15 min，加入 5 μL PI 混勻，再補加 200 μL 的 DMEM 后，上流式細胞儀進行檢測，重復3次，求平均值。

1.2.7

Western blotting 檢測HMGBI 蛋白表達 將上述處理組細胞用預冷PBS 洗滌3 遍，加入含有PMSF（100 倍稀釋）的細胞裂解液，利用BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，然后進行SDS-PAGE電泳，采用濕轉法將蛋白轉至PVDF 膜上，用5% 脫脂奶粉4 ℃過夜封閉，用HMGB1和β-actin的一抗進行4 ℃過夜孵育，用辣根過氧化物標記山羊抗鼠二抗進行37 ℃溫箱孵育，PBST 洗膜3 次，用混好的ECL 化學發光液滴加至膜上，化學發光成像儀下掃描并拍照，同時以β-actin 為內參，對目的蛋白HMGB1做相對定量分析。

2 結果

2.1 miR

-

338

-

3p 在子宮內膜癌細胞中低表達

RT-qPCR 檢測miR-338-3p 在人正常子宮內膜上皮細胞ESC 及子宮內膜癌細胞HEC-1B 和Ishikawa 的表達，結果顯示，與人正常子宮內膜上皮細胞ESC相比，miR-338-3p 在子宮內膜癌細胞HEC-1B 和Ishikawa 中表達顯著下調［（1.00±0.10）比（0.51±0.04），（0.46±0.04），

F

=182.114，

P

=0.000；

t

=13.649，

P

=0.000，

t

=15.041，

P

=0.000］。

2.2 過表達miR

-

338

-

3p 抑制子宮內膜癌細胞增殖、促進凋亡和增加子宮內膜癌細胞對PTX 的敏感性

將miR-338-3p mimics 轉染至HEC-1B 和Ishikawa 細胞中，RT-qPCR 檢測結果顯示，miR-338-3p 在HEC-1B［（1.00±0.10）比（4.87±0.31），

t

=35.643，

P

=0.000］和Ishikawa［（1.00±0.09）比（6.11±0.43），

t

=34.895，

P

=0.000］細胞中表達顯著上調；CCK-8 法檢測結果和流式細胞術結果顯示：與miR-NC 組相比，miR-338-3p 組細胞的增殖能力降低（表1），而細胞凋 亡 率 顯 著 增 加［HEC-1B ：（10.02±0.86 ） 比（23.10±1.86），

t

=19.149，

P

=0.001；Ishikawa ：（10.01±0.91）比（25.43±2.01），

t

=20.966，

P

=0.000］；不同濃度的PTX 聯合miR-338-3p 對子宮內膜癌細胞增殖能力的影響：CCK-8 實驗結果顯示，HEC-1B 和Ishikawa 細胞的存活分數隨著紫杉醇濃度的增加而逐漸下降，與miR-NC 組相比，miR-338-3p 組細胞存活分數均明顯下降（HEC-1B：

t

=1.401，

P

=0.925，

t

=1.234，

P

=0.051，

t

=5.152，

P

=0.006，

t

=14.787，

P

=0.004，

t

=14.482 ，

P

=0.004，

t

= 15.614，

P

=0.000，

t

=14.221，

P

=0.003，

t

=0.152，

P

=0.473），（Ishikawa：

t

=1.663，

P

=0.825，

t

=3.35，

P

=0.041，

t

=6.176，

P

=0.012，

t

=7.944，

P

=0.008，

t

=15.013 ，

P

=0.001，

t

=16.063，

P

=0.000，

t

=15.022，

P

=0.001，

t

=0.676，

P

=0.758）。

表1 CCK-8檢測細胞增殖活力/（，n=9）

2.3 miR

-

338

-

3p 的

靶

基

因

HMGB1

RT-qPCR 檢測HMGB1 表達，與人正常子宮內膜上皮細胞ESC相比，HMGB1 在子宮內膜癌細胞HEC-1B 和ishikawa 中表達上調［（1.00±0.10）比（4.31±0.32）、（3.24±0.26），

F

=64.240，

P

=0.000］；生物學在線預測分析軟件 Targetscan 預 測 到 miR-338-3p 與 HMGB1 的 3’UTR 存在結合位點（圖1A）；雙熒光素報告基因實驗驗證miR-338-3p 與HMGB1 之間的靶向關系，結果顯示：miR-338-3p 能顯著降低野生型HMGB1-3’UTR WT 的 熒 光 活 性［HEC-1B：（1.00±0.11 ） 比（0.44±0.03），

t

=17.709，

P

=0.000；ishikawa：（1.00±0.11）比（0.47±0.04），

t

=13.584，

P

=0.000］，但卻不影響 HMGB1-3’UTR MUT 的熒光活性［HEC-1B：（1.00±0.12）比（1.01±0.10），

t

=0.212，

P

=0.835；ishikawa：（1.00±0.12 ） 比（1.01±0.10），

t

=0.192，

P

=0.850］；Western blotting 檢測結果顯示，與 miR-NC組相比，過表達miR-338-3p 可顯著降低HMGB1 在HEC-1B［（1.00±0.10）比（0.44±0.03），

t

=16.091，

P

=0.000］和 ishikawa［（1.02±0.11）比（0.47±0.04），

t

=14.097，

P

=0.000］細胞中的表達（圖1B）。

圖1 miR-338-3p與HMGB1之間的靶向關系驗證：A為miR-338-3p與HMGB1的3’UTR存在結合位點；B為過表達miR-338-3p對HMGB1表達的影響

2.4 敲低HMGB1 抑制子宮內膜癌細胞增殖、促進凋亡和增加子宮內膜癌細胞對PTX 的敏感性

將si-HMGB1 轉染至 HEC-1B 和 ishikawa 細胞，Western blotting 結果顯示，與 si-NC 組相比，si-HMGB1 組細胞中HMGB1 表達顯著降低［HEC-1B：（1.00±0.10）比（0.44±0.03），

t

=16.091，

P

=0.000；ishikawa：（1.00±0.09）比（0.48±0.04），

t

=15.839，

P

=0.000］；CCK-8法檢測結果和流式細胞術結果顯示：與si-NC 組相比，si-HMGB1 組細胞的增殖能力降低（表2），而細胞 凋 亡 率 顯 著 增 加［HEC-1B：（10.02±0.91 ） 比（24.30±1.96），

t

=19.825，

P

=0.000，ishikawa：（10.01±1.01）比（22.72±1.76），

t

=18.791，

P

=0.000］；不同濃度的PTX 聯合si-HMGB1 對子宮內膜癌細胞增殖能力的影響：CCK-8 實驗結果顯示，HEC-1B 和Ishikawa 細胞的存活分數隨著紫杉醇濃度的增加而逐漸下降，與si-NC組相比，si-HMGB1組細胞存活分數均明顯下降（HEC-1B：

t

=1.332，

P

=0.657，

t

=1.742，

P

=0.146，

t

=5.243，

P

=0.024，

t

=5.342，

P

=0.011，

t

=14.522，

P

=0.000，

t

=16.162，

P

=0.001，

t

=13.594，

P

=0.001，

t

=0.152，

P

=0.421；Ishikawa：

t

=1.356，

P

=0.745，

t

=3.321，

P

=0.086，

t

=6.313，

P

=0.016，

t

=8.224，

P

=0.016，

t

=15.175，

P

=0.000，

t

=16.394，

P

=0.000，

t

=14.943，

P

=0.001，

t

=0.974，

P

=0.343）。

表2 CCK-8檢測細胞增殖活力/（，n=9）

2.5 HMGB1 部分逆轉miR

-

338

-

3p 對子宮內膜癌細胞增殖、凋亡及對PTX 敏感性的影響

將miR-338-3p 和 pcDNA3.0HMGB1 共 轉 染 至 HEC-1B 和ishikawa 細胞，與 miR-338-3p 組相比，miR-338-3p+HMGB1 組細胞增殖能力升高（表3），細胞凋亡率降低（表4）；不同濃度的PTX 聯合pcDNA3.0 HMGB1和miR-338-3p mimics 對子宮內膜癌細胞增殖能力的影響：CCK-8 實驗結果顯示，HEC-1B 和 Ishikawa細胞的存活分數隨著紫杉醇濃度的增加而逐漸下降，與miR-338-3p組相比，miR-338-3p+HMGB1組細胞存活分數升高（HEC-1B：

F

=1.021，

P

=0.6425，

F

=0.493，

P

=0.326，

F

=22.943，

P

=0.000，

F

=42.070，

P

=0.000，

F

=85.374，

P

=0.000，

F

=188.411，

P

=0.000，

F

=90.020，

P

=0.000，

F

=0.682，

P

=0.216；ishikawa ：

F

=1.011，

P

=0.689，

F

=0.301，

P

=0.281，

F

=19.020，

P

=0.000，

F

=35.882，

P

=0.000，

F

=83.360，

P

=0.000，

F

=243.824，

P

=0.000，

F

=127.017，

P

=0.000，

F

=0.694，

P

=0.846）。

表3 CCK-8檢測細胞增殖活力/（，n=9）

表4 流式細胞儀檢測細胞凋亡/（，n=9）

3 討論

MiRNAs 是 一類長度 約為 19 至 23 個 nt 的 高 度保守的內源性非編碼小分子RNA，能夠通過與靶基因的mRNA 的3’UTR 不完全互補配對進而影響mRNA 的降解或抑制其翻譯。研究表明有多種miRNAs 通過調控子宮內膜癌的增殖，遷移侵襲和凋亡等種生物學過程，參與癌癥的發生發展。miR-338-3p 在多種癌癥中發揮多種調控作用，如Ju等發現 miR-338-3p 可抑制胃癌細胞的發展，Peng等發現miR-338-3p 可通過IRS2 抑制非小細胞肺癌的增殖和侵襲，但 miR-338-3p 在子宮內膜癌細胞中的研究較少。本研究以人子宮內膜癌細胞HEC-1B和ishikawa為研究對象，RT-qPCR檢測發現，與人正常子宮內膜上皮細胞ESC 相比，miR-338-3p 在HEC-1B 和ishikawa 細胞中的表達顯著下調，提示我們miR-338-3p 可能在子宮內膜癌的發生發展中發揮重要作用。后續研究中在HEC-1B 和ishikawa 細胞中過表達miR-338-3p，檢測發現過表達miR-338-3p 可抑制 HEC-1B 和 ishikawa 細胞增殖，促進其凋亡，提示miR-338-3p 可能成為子宮內膜癌潛在的治療靶點。PTX 是一種來自紫衫樹皮的提取物，通過影響腫瘤細胞的有絲分裂和細胞周期發揮作用，是臨床一線抗腫瘤藥物，不斷有研究表明PTX 可聯合其它化療藥物抑制子宮內膜癌的進展。在本研究中，首先檢測了不同濃度的PTX 聯合miR-338-3p對HEC-1B和ishikawa細胞增殖的影響，結果與前人研究一致，隨著 PTX 的提高，HEC-1B 和 ishikawa 細胞的增殖能力降低，表明PTX 可抑制HEC-1B 和ishikawa 細胞的增殖，同時，與 miR-NC 組相比，miR-338-3p 組的細胞增殖能力降低，表明過表達miR-338-3p 可增加 HEC-1B 和 ishikawa 細胞對 PTX 的敏感性。

有研究表明HMGB1 參與多種癌癥的發生發展過程。本研究首先檢測了HMGB1在HEC-1B和ishikawa 細胞中的表達，結果發現，與人正常子宮內膜上皮細胞 ESC 相比，HMGB1 在 HEC-1B 和 ishikawa 細胞中的表達顯著上調，提示我們HMGB1 可能在子宮內膜癌的發生發展中發揮重要作用。而HMGB1 對其他癌癥的影響前人早有報道，如miR34a可靶向HMGB1抑制人宮頸癌和結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲，HMGB1 促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲，抑制細胞凋亡。這些數據表明HMGB1在多種癌癥中可能扮演著促癌基因的角色。為了驗證miR-338-3p 是否可靶向HMGB1 參與子宮內膜癌的發生發展以及其對PTX 的敏感性，本研究通過生物信息學在線分析軟件預測到HMGB1 的3’UTR與miR-338-3p 存在結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗證實HMGB1 是miR-338-3p 的靶基因，且過表達miR-338-3p 可抑制HMGB1 表達，表明miR-338-3p 可靶向并負性調節HMGB1 表達。后續研究中在HEC-1B 和 ishikawa 細 胞 中 敲 低 HMGB1，敲 低HMGB1 可抑制 HEC-1B 和 ishikawa 細胞增殖，促進其凋亡，同時增加HEC-1B和ishikawa細胞對PTX的敏感性，與過表達miR-338-3p結果相一致。HMGB1和miR-338-3p共轉染至HEC-1B和ishikawa細胞，結果發現HMGB1 可部分逆轉miR-338-3p 對子宮內膜癌細胞增殖，凋亡以及對PTX敏感性的影響。

綜上所述，本研究首次發現miR-338-3p 靶向HMGB1可促進人子宮內膜癌細胞HEC-1B和ishikawa凋亡、抑制增殖，同時增加其對PTX 的敏感性，為臨床上miR-338-3p 聯合PTX 治療人子宮內膜癌提供了理論依據。