微小RNA361-5p在肺結核病人血清中水平及意義

賈宗嶺，單富強，葛國昌，趙幸娜

肺結核是臨床常見的由結核分枝桿菌導致的嚴重傳染性疾病，其發病率和病死率極高，給病人心理及生理帶來沉重負擔。肺結核發病除與肺部感染結核菌有關外，還與表達異常的微小RNA（microRNA，miRNA）和炎癥因子密切相關。miR-140在肺結核病人外周血中表達異常，其可能通過調節促炎因子水平參與并影響肺結核發病進展。miR-361-5p 在肺結核病人血漿中呈高表達，可作為肺結核診斷的有效標志物。此外，結核分枝桿菌入侵人體時，機體會產生大量炎癥反應相關因子，其水平可一定程度用于篩查肺結核，炎癥反應相關因可能在結核病發生發展過程發揮重要作用。但微小RNA-361-5p（miRNA-361-5p，miR-361-5p）在肺結核血清中的表達水平及意義鮮有研究。本研究通過初步檢測miR-361-5p 在肺結核中血清中的水平，分析miR-361-5p 與炎癥相關因子的關系，以期為診治肺結核提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取 2017 年 3 月至 2019 年 1 月開封市結核病防治所診治的肺結核病人136例進行研究（肺結核組），男 76 例，女 60 例；年齡（44.01±10.52）歲，年齡范圍為 31～57 歲；體質量指數（BMI）（20.84±2.87）kg/m，BMI 范圍為 17.01～24.86 kg/m。并以同期本院體檢正常者142 例進行對照研究（健康對照組），男 78 例，女 64 例；年齡（43.94±10.47）歲，年齡范圍為29～56歲；BMI為（21.08±2.93）kg/m，BMI 范圍為 17.25～25.09 kg/m。兩組年齡、性別、BMI比較，差異無統計學意義（

P

＞0.05）。

納入標準：（1）符合《肺結核診斷和治療指南》中肺結核診斷標準者；（2）病歷資料齊全者；（3）病人本人自愿參該項研究，并簽署知情同意書。排除標準：（1）合并糖尿病、心肝腎功能異常、肺癌者；（2）合并過敏體質者或妊娠、哺乳期女性；（3）合并精神類障礙或其他免疫、慢性疾病者；（4）近期使用糖皮質激素、抗感染、免疫等影響炎癥反應藥物者。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1

樣本收集 采集肺結核病人入院第二日及體檢正常者清晨空腹肘靜脈血約5～6 mL，室溫下靜置約30 min，以3 500 r/min 離心 5 min，收集上清，分裝于1.5 mL EP 管中，密封，儲存于-80 ℃冰箱中，備用。

1.2.2

實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測血清中miR-361-5p 表達水平 取出-80 ℃中適量血清樣本，無菌環境下，冰上解凍，按TRIzol 法提取總RNA，具體操作按TRIzol試劑（BYX1617P，常州貝源鑫生物科技有限公司）說明書進行。以紫外分光光度計（Nano EX，澤尼薩爾有限公司）檢測RNA 濃度、純度，并驗其完整性。根據miScript Reverse Transcription Kit（218061，上海北諾生物科技有限公司）說明書將RNA 逆錄成cDNA。利用TaqMan? Fast Advanced Master Mix（4444557，杭州沃森生物技術有限公司）及PCR 儀（Rotor-Gene Q，凱杰企業管理有限公司）將cDNA 擴增，qPCR 檢測。miR-361-5p以 U6 為內參，其應引物序列如表 1 所示。以 2法計算miR-361-5p相對表達量。

表1 miR-361-5p及內參U6的引物序列

1.2.3

血清血管內皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）水平檢測 從-80 ℃冰箱中取出分裝的血清樣本，室溫下解凍，利用人VEGF 酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（貨號：KHG0111，上海研卉生物科技有限公司）、TNF-α ELISA 試劑盒（OSD_H0170，長沙達爾鋒生物科技有限公司）、IFN-γ ELISA 試劑盒（BS-E3748H1，廣州徠智生物科技有限公司）按ELISA 法測定血清VEGF、TNF-α、IFN-γ水平。

2 結果

2.1 兩組血清

miR

-

361

-

5p、VEGF、TNF

-α

、IFN

-γ

水平比較

與健康對照組相比，肺結核組組病人血清 miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水 平 較 高（均

P

＜0.05），IFN-γ水平明顯較低（

P

＜0.05）。見表2。

表2 兩組血清miR-361-5p、血管內皮生長因子（VEGF）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、γ-干擾素（IFN-γ）水平比較/

2.2 肺結核病人血清miR

-

361

-

5p 水平與VEGF、TNF

-α

、IFN

-γ

關系

Pearson 法相關性分析顯示，肺結核病人血清 miR-361-5p 與 VEGF、TNF-α 水平呈正相關（

r

=0.585、0.539，

P

均＜0.05），與IFN-γ 水平呈負相關（

r

=0.485，

P

＜0.05）。

2.3 影響肺結核的Logistic回歸分析

以miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ水平為自變量，以肺結核是否發生為因變量，行Logistic 回歸分析，結果顯示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影響肺結核發生的危險因素（均

P

＜0.05），IFN-γ 是影響肺結核發生的保護因素（

P

＜0.05）。見表3。

表3 Logistic回歸分析肺結核發生的影響因素

2.4 血清miR

-

361

-

5p 對肺結核的診斷價值

ROC曲線顯示，血清miR-361-5p 水平對肺結核發生診斷的曲線下面積（Area Under Curve，AUC）為 0.898（95%

CI

：0.860～0.936），截斷值為1.44，其靈敏度、特異度分別為83.82%、88.03%。見圖1。

圖1 血清miR-361-5p表達水平預測肺結核發生的ROC曲線

3 討論

肺結核是一種傳染性較強的肺部感染疾病，以乏力、午后低熱、盜汗、咯血為主要臨床癥狀，可導致肺癌。因此，尋找可高效診治肺結核的指標，對提高肺結核病人生活和生存質量極具重要意義。

miRNA 是廣泛分布于人體外周血的非編碼小RNA，可參與調控新陳代謝、氧化應激、炎癥反應等過程，與肺炎、肺結核、肺纖維化、肺癌等肺部損傷類疾病。miR-133a 在肺纖維化中表達失調，其可能參與并影響肺纖維化發展進程，miR-133a 有望成為治療肺纖維化的靶標。miR-423-5p 在肺結核病人血清中表達上調，其可通過調節自噬小體-溶酶體融合，進而在肺結核中起關鍵調節作用，可作為肺結核診斷的有效指標。miR-130b 在肺癌中呈高表達，其可能參與肺癌發生發展，miR-130b 具有診斷肺癌的潛在價值。此外，Ndzi 等研究發現miR-361-5p 在肺結核中表達異常，其有望成為診斷肺結核的生物指標。miR-361-5p 在肺癌中異常表達，其可能在非小細胞肺癌進展中起一定調控作用，且可作為非小細胞肺癌預后評估指標。本研究中肺結核組病人血清miR-361-5p 水平明顯高于健康對照組，提示miR-361-5p 可能在肺結核發生發展進程中起一定作用。

肺結核發展過程與免疫細胞分泌的多種炎癥相關因子有關。其中，VEGF 是機體內促血管生長的重要因子，可由肺單核細胞、巨噬細胞分泌，影響結核結節、干酪樣壞死，與多種炎性疾病緊密相關。TNF-α 是多功能細胞因子，可與巨噬細胞一起抵抗結核桿菌的感染，對機體釋放其他抵抗結核細胞因子具有關鍵作用。此外，IFN-γ 可激活免疫細胞，在抗結核過程發揮重要作用，肺結核病人血清中TNF-α、VEGF 水平升高，IFN-γ 水平降低；經結核藥聯合利福噴丁治療后，TNF-α、VEGF 水平降低，IFN-γ 水平升高，TNF-α、VEGF、IFN-γ 均可能參與且影響肺結核發病進展。本研究中肺結核組病人血清VEGF、TNF-α 水平均明顯高于健康對照組，IFN-γ 水平明顯低于健康對照組，提示炎癥相關因子TNF-α、VEGF、IFN-γ可能在肺結核發病過程中起一定作用。

miR-361-5p 在冠心病中可調節VEGF 表達，這種調節方式適用于血管新生、缺血性相關疾病。本研究中肺結核病人血清miR-361-5p 與VEGF、TNF-α 水平呈正相關，與 IFN-γ 水平呈負相關，提示miR-361-5p可能與VEGF、TNF-α、IFN-γ等炎癥相關因子相互作用，共同影響肺結核發生與發展。本研究顯示，miR-361-5p、VEGF、TNF-α 是影響肺結核發生的危險因素，IFN-γ 是影響肺結核發生的保護因素，提示miR-361-5p、VEGF、TNF-α 水平升高、IFN-γ水平降低，均可能使肺結核患病風險升高，及時監測miR-361-5p、VEGF、TNF-α、IFN-γ 水平有利于及早診治肺結核。進一步研究發現，血清miR-361-5p水平對肺結核發生診斷的AUC 為0.898，當血清miR-361-5p 相對表達量高于1.44 時，肺結核發病幾率增加，提示血清miR-361-5p 對肺結核有較高診斷價值。

綜上所述，肺結核病人血清miR-361-5p 表達上調，miR-361-5p 與炎癥相關因子具有一定相關性，其可能與炎癥因子共同影響肺結核疾病病變過程。本研究存在樣本較少，可能引起實驗出現誤差，此外，本研究未比較miR-361-5p與VEGF、TNF-α、IFN-γ 及各項聯合診斷肺結核的價值，后續將擴大樣本比較上述各指標診斷肺結核的價值及其與肺結核類型的關系。