復方血栓通膠囊對老年糖尿病腎病維持性血液透析的治療效果及作用機制

陳拉斯 王婷婷 李來梅

(海南醫學院第一附屬醫院 1血液凈化科，海南 海口 570102；2腎內科；3海南省兒童醫院兒科)

糖尿病腎病(DN)是導致終末期腎病的重要原因之一，維持性血液透析雖然能夠作為一種代替療法，提高未進行腎臟移植的終末期腎病患者的長期生存率，但終末期腎衰竭患者的致死率仍然很高，特別是對于老年DN患者而言，由于腎功能及免疫功能降低使得其病死風險較年輕群體更高〔1〕。迄今為止，DN的發病機制尚未完全明確，可能是多因素參與并作用的結果，持續高糖環境所造成的血管新生、氧化應激反應、免疫應答紊亂、持續慢性炎癥反應等均與其發病有關〔2〕。中醫觀點指出，氣陰兩虛兼血瘀證是DN的主要證型，治療宜充足氣陰，即化瘀活血、養陰益氣；緩解痰瘀停滯，即強盛脾腎，保氣血通暢。復方血栓通主要成分為三七、丹參和黃芪，主要功效為祛濕化瘀，補益脾腎氣陰兼顧，使全身臟腑功能得到活動，從而具備抗菌、消炎、抗氧化、降低炎癥復合物沉積及改善腎小球硬化等作用〔3〕。現階段，在DN早期治療中常應用復方血栓通，而在DN患者維持性血液透析中應用該藥物，目前暫無報道，尤其是對于65歲以上老年群體的研究更為罕見。基于此，本研究通過觀察老年DN維持性血液透析患者在復方血栓通治療前后氧化應激、血管新生因子、Th1/Th2相關細胞因子及核因子(NF)-κB信號通路的變化，初步研究復方血栓通的作用及相關機制，將為更多DN患者的治療奠定相關實踐基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 取2017年10月至2019年1月于海南醫學院第一附屬醫院接受維持性血液透析治療的老年DN患者78例，納入標準：①西醫診斷符合《實用內科學》中的相關標準〔4〕；②中醫診斷符合《糖尿病腎病診斷、辨證分型及療效評定標準》中的氣陰兩虛型〔5〕；③無合并其他嚴重軀體及精神疾患者；④年齡≥65歲；⑤透析時間>6個月，病情穩定；⑥患者及家屬均自愿參加并簽署知情同意書。排除標準：①病情進展需要緊急終止者；②入組1個月前曾接受過降脂、抗凝藥物治療者；③合并嚴重神經、代謝、內分泌系統疾病者；④不良反應程度重，如對藥物過敏、出現嚴重的消化道反應難以控制；⑤同時伴有惡性腫瘤或其他血液系統疾病的患者；⑥患者重要臟器存在功能障礙，如心、肝、肺。78例患者隨機分為治療組及對照組，每組各39例。治療組男21例，女18例；對照組男23例，女16例。治療組年齡65～80歲，平均年齡為(71.12±8.59)歲；對照組65～82歲，平均年齡為(70.51±8.39)歲。治療組體重45.50～68.39 kg，平均體重為(59.20±8.87)kg；對照組體重44.68～69.29 kg，平均體重為(58.12±8.169)kg。透析時間，治療組1～14個月，平均時間為(8.20±1.29)個月；對照組1～13個月，平均時間為(8.30±1.19)個月。兩組數據間無顯著差異(P>0.05)，因此該數據符合繼續研究要求。

1.2方法 兩組患者給予同樣的常規治療，包括：藥物維穩血糖、血脂、血壓，糾正電解質紊亂、改善貧血等，同時進行血液透析，高通量透析設備為B.Braun Avitum AG的聚砜膜透析器，透析液為含135～145 mmol/L鈉離子、2.0 mmol/L鉀離子、1.25～1.50 mmol/L 鈣離子的碳酸氫鹽溶液。全部透析器配備內毒素過濾器，所有設備不得重復使用。對于透析設備試劑質控如下：透析液細菌菌落數<100 CFU/ml，內毒素<0.25 EU/ml。透析過程設置如下：透析液流量500 ml/min，血流量200～300 ml/min，4 h/次，3次/w。治療組在此基礎上額外加以口服復方血栓通膠囊(廣東眾生藥業股份有限公司，國藥準字：Z20030017，規格0.5 g/粒)，每次3粒，每日3次。每組均治療8 w。

1.3觀察指標 ①抽取患者治療前與治療后晨起空腹外周靜脈血3 ml，血液靜置后，以3 000 r/min離心5 min，提取血清并低溫環境凍存，以備后續實驗。對患者腎功能指標水平進行以下檢測：24 h尿蛋白定量(Pr)、血清白蛋白(ALB)、血肌酐(Scr)等，采用美國貝克曼CX7+型全自動生化儀。②提取血清方法同上，檢測血清中血管新生因子〔血管生成素(Ang)1、Ang2、血管內皮生長因子(VEGF)〕和Th1/Th2相關細胞因子〔白細胞介素(IL)-4、IL-6、IL-10、IL-1β、腫瘤壞死因子(TNF)-α〕等水平，氧化應激相關產物原花青素(PC)、8-羥基脫氧鳥苷(OHdG)的含量等，以上均應用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)進行檢測。丙二醛(MDA)的含量采用硫代巴比妥酸反應物(TBARS)比色法試劑盒測定，全部試劑盒購自上海哈靈生物科技有限公司。③取上述靜脈血離心沉淀，采用逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)測定血漿中p50、p65、人核因子κB抑制蛋白α(IκBα)mRNA、Iκβ激酶β(IKKβ)等NF-κB信號通路相關指標基因表達。參照試劑盒說明書分別提取細胞總RNA，進行逆轉錄，以逆轉錄產物cDNA為樣本應用實時熒光定量PCR儀進行擴增，管家基因β-actin作為內參，引物設計由Primer軟件完成，計算2-ΔΔCt即為目的基因mRNA相對表達水平，引物由生工生物工程股份有限公司合成。見表1。④對患者均保持6個月有效隨訪，并關注其不良反應發生情況。

表1 Real time-PCR引物序列

1.4統計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1兩組腎功能指標水平比較 兩組治療前Pr、Scr、ALB無顯著差異(P>0.05)；治療后，兩組Pr、Scr均明顯下降，ALB均明顯升高，且相較于對照組，治療組Pr、Scr下降水平顯著更低(P<0.01)，ALB升高水平顯著更高(P<0.01)。見表2。

表2 兩組腎功能指標水平比較

2.2兩組氧化應激相關產物水平比較 兩組治療前PC、8-OHdG、MDA水平無顯著差異(P>0.05)；治療后，兩組PC、8-OHdG、MDA均明顯下降，且相比于對照組，治療組下降程度更顯著(P<0.01)。見表3。

表3 兩組氧化應激相關產物水平比較

2.3兩組血管新生因子表達情況比較 治療前，兩組Ang1、Ang2、VEGF的表達無顯著差異(P>0.05)；兩組治療后Ang1、Ang2、VEGF水平均明顯下降，治療組相較于對照組上述因子降低趨勢更為顯著(P<0.01)。見表4。

2.4兩組NF-κB信號通路相關指標基因表達比較 兩組患者p50、p65、IKKβ、IκBα mRNA基因表達水平在治療前基本無異(P>0.05)；隨著兩組方案治療的進行，患者的p50、p65、IKKβ、IκBα mRNA基因表達均明顯下降，且通過數據統計發現，治療組相較于對照組上述基因表達水平降低趨勢更為顯著(P<0.01)。見表4。

表4 兩組血管新生因子及NF-κB信號通路相關指標基因表達比較

2.5兩組Th1/Th2相關細胞因子比較 治療前，兩組IL-4、IL-6、IL-10、IL-1β、TNF-α比較無統計學意義(P>0.05)，治療后，兩組IL-6、IL-1β、TNF-α均明顯下降，IL-4、IL-10均明顯升高，且相較于對照組，治療組IL-6、IL-1β、TNF-α下降水平顯著更低(P<0.01)，IL-4、IL-10升高水平顯著更高(P<0.01)。見表5。

表5 兩組Th1/Th2相關細胞因子比較

2.6兩組不良反應比較 全部受試者治療過程中，納差在治療組中出現1例，對照組中出現3例；頭暈在治療組中出現1例，對照組中出現5例，對比兩組間不良反應發生率有顯著性差異(P<0.05)，以上不良反應在積極治療后得以緩解。

3 討 論

DN作為糖尿病患者常見的嚴重慢性微血管并發癥之一，具有起病隱患，并可持續數年的特點。早期DN患者僅表現出腎小球濾過功能異常和微量白蛋白尿，隨著疾病的進展，腎小球負擔加重的患者，容易不可逆轉的損害到腎功能，最終發展為終末期腎臟疾病，嚴重威脅人類健康和生命。目前，在臨床治療中廣泛使用的維持性血液透析技術已經提高了慢性腎臟病的存活率〔6〕。但是在DN患者中存在著透析膜和透析液之間的生物不相容，再加上細菌內毒素的直接入侵，導致大量的炎癥細胞被激活，從而引起炎癥級聯擴增反應造成內臟的功能障礙。炎癥細胞同時進行的“呼吸爆發”釋放出大量的氧自由基，引起機體的氧化應激，最終使體內的氧化和抗氧化失衡，愈發趨于氧化，脂質過氧化損害了腎小球，誘發腎間質水腫，并加重病情〔7〕。

NF-κB為調節基因轉錄主要因子，在炎癥反應起始及發展過程中起關鍵作用〔8〕。NF-κB的激活途徑主要包含經典途徑和旁路途徑。NF-κB在靜息狀態下，以p50/p65二聚體形式存在于細胞質中，抑制IκB與兩個亞基形成的同源和(或)異源二聚體再進行結合，成為無活性的三聚體。然而發生炎癥反應時，IκB被磷酸化、泛素化，阻止NF-κB進入胞核與DNA結合，隨后p50/p65被釋放并發生核轉位，結合于相應靶基因上的κB位點，從而對基因轉錄起調節作用〔9〕。而非經典NF-κB信號通路是IKKα介導的，當發生腎損傷時，在相關改變的刺激下，NF-κB誘導激酶作用，磷酸化激活細胞內IKKa，形成以p52為特征的信號通路，其在細胞核內與目的基因結合，調控基因表達〔10〕。細胞因子作為炎癥反應的重要介質，是DN免疫炎癥主要參與者，而NF-κB在這一過程中起信號轉導樞紐作用，是機體免疫炎癥反應的關鍵調控者，活性同時受到細胞內和細胞外反饋調節的影響。在刺激作用下，細菌內毒素可通過正反饋調節促使炎癥反應信號進一步擴散，激活NF-κB，并使得受到IL-4、IL-10等抑炎細胞因子制約的IL-6、IL-1β、TNF-α等促炎細胞因子大量轉錄，而后者亦可反調節NF-κB，使其激活，形成促炎因子的放大效應，生成更多的細胞因子，影響正常機體的Th1/Th2動態平衡〔11〕。本研究結果顯示，老年DN維持性血液透析患者存在Th1/Th2失衡，并且失衡向免疫炎癥方向漂移，但經復方血栓通膠囊輔助治療后，患者機體Th1/Th2動態平衡狀態得到顯著改善，這可能與復方血栓通膠囊通過抑制NF-κB信號通路活化，調節細胞因子的變化有關。

有研究發現〔12〕，氧化應激作用的對象是脂質、核酸、蛋白質，即當內皮細胞、基底膜細胞中內活性氧自由基的生成和消除的動態平衡遭到破壞后，可引起三者過氧化損傷，引起細胞的凋亡。其中PC是蛋白質氨基酸側鏈發生氧化反應的產物，8-OHdG是核酸中鳥嘌呤被氧化的產物，脂質過氧化的產物是MDA。本研究結果復方血栓通膠囊輔助治療可顯著抑制氧化應激反應、減少氧化產物的生成并增強抗氧化能力。分析原因可能與復方血栓通膠囊所含的黃芪、丹參均為補血之品，可益氣活血、化瘀通絡、走而不守，具有引經之效，明顯改善多臟器的供血，從而起到抗氧化的作用。

相關實驗研究表明〔13〕，作為典型的微血管并發癥，血管內皮損傷以及功能障礙在DN的發生發展中有著重要的作用，患者多表現為病灶局部的血管通透性顯著增加、血管生成量明顯增多。Ang家族是近年來新發現的一種內皮細胞特異性促血管生成因子，包括Ang1和Ang2，均可以通過與受體絡氨酸激酶受體(TiE)2結合而參與各種生理和病理性血管生成〔14〕。VEGF也是一種重要的促進患者血管生成的介導因子。它可以加速血管生成并顯著促進血管內皮細胞的增殖和血管滲漏作用〔15〕。腎小球局部Ang1、Ang2、VEGF表達增加，會引發血管的細胞外基質沉積，血管內皮細胞增殖能力增強，血管內皮功能完整性破壞，共同損傷機體腎小球濾過功能。本研究對上述血管新生因子水平進行檢測后發現，復方血栓通膠囊輔助治療可有效調節老年DN維持性血液透析患者血清中血管活性分子表達水平，以改善微循環狀態，避免進一步損害腎小球濾過功能。其產生有效作用可能是由于，在組成復方血栓通的藥物中，包含降低血液黏稠度的三七黃酮，間接減少紅細胞聚集率，改善微循環；三七皂苷，能夠有效促進肝、腎和血清蛋白質的合成，保護缺血組織中的微血管膜的穩定性。

此外，比較兩組方案不良反應發生率發現，治療組加以復方血栓通膠囊口服，并沒有產生更多不良反應，相反還降低了患者因長期血液透析所致的不良反應發生。這可能由于復方血栓通膠囊本身對人體正常細胞的細胞毒性和對組織器官毒性作用均較弱，且能夠通過提高患者機體免疫功能以改善因血液透析所引入的毒副作用。但本研究亦存在不足之處，即樣本量過小，未施盲法等因素，在后續研究中仍需行大樣本、多中心的雙盲試驗，以更有效地探索對于老年DN維持性血液透析患者來說，復方血栓通膠囊輔助治療的最終效應。