三氯生通過ERK/NF-κB/MMP-2/-9途徑促進卵巢癌細胞遷移和侵襲

張瑛瑜 徐宏仙 楊林峰 陳芳

(1三亞市中醫院婦產科，海南 三亞 572000；2中南大學湘雅醫學院附屬海口醫院婦產科)

卵巢腫瘤是全世界女性最常見的惡性腫瘤之一，該病常在晚期被診斷，并有腹腔內轉移〔1〕，死亡率高達60%～65%〔2〕。當病變局限于卵巢時，5年生存率高于90%，但當病變在腹腔內播散時，生存率低于20%〔3〕。因此，明確該病發病機制，將為該病的診斷與治療提供極大幫助。內分泌干擾物(EDCs)是環境中天然或人工合成的制劑，可干擾體內激素正常功能，從而對內分泌系統產生干擾作用〔4〕。而人體內正常激素的循環水平可能與幾種生殖系統癌癥的風險密切相關。如雌激素水平異常與卵巢、乳腺及宮頸腫瘤的發生發展有關〔5～7〕，這些腫瘤是高雌激素受體陽性或雌激素反應性腫瘤。因此，具有雌激素或雌激素活性的EDCs可能是發生雌激素反應性癌癥的重要危險因素。三氯生(TCS)是一種合成的氯化苯醚雙酚，用作廣譜抗菌劑〔8〕。TCS是肥皂、除臭劑、牙膏等衛生產品的常見成分，使用濃度高達0.3%〔9〕。盡管TCS尚未被歸類為EDCs，但已被認為是一種潛在EDC〔10〕。既往有研究發現，TCS可通過雌激素受體依賴途徑調節卵巢癌細胞周期和凋亡相關基因的表達，從而刺激細胞生長〔11〕，然而TCS對卵巢癌細胞其他惡性生物學功能的影響尚未被闡明。本研究旨在分析TCS對卵巢癌細胞遷移和侵襲功能的作用及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1一般資料 細胞培養卵巢癌細胞系A2780購自美國ATCC，使用含10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM培養基(Gibco，美國)，在37℃、5% CO2的培養箱中培養。

1.2CCK-8 檢測細胞活性以1×104個/孔的密度將A2780細胞接種于96孔板中，以不同濃度TCS(Sigma Aldrich，美國)(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)暴露細胞24 h，隨后向每孔加入10 μl CCK-8試劑(Dojindo，日本)，放回培養箱繼續孵育2 h后置于分光光度計中測定450 nm波長處的吸光度(OD)。細胞相對活性=(處理組OD450-背景組OD450)/(對照組OD450-背景組OD450)。每組設置4個復孔。

1.3細胞劃痕實驗 檢測細胞遷移能力以5×105/孔的密度將A2780細胞接種于6孔板中，待細胞融合至90%時，用20 μl移液管尖刮除細胞，用無血清DMEM沖洗細胞2次。分別將細胞暴露于含0、10-8、10-6mol/L TCS的無血清DMEM中再培養24 h，培養結束后對劃痕區域進行顯微鏡觀察和成像，使用Image J計算劃痕面積(Area)。細胞相對遷移活性(%)=(處理組Area 24 h-處理組Area 0 h)/(對照組Area 24 h-對照組Area 0 h)×100%。

1.4細胞侵襲實驗(Transwell) 測定細胞侵襲能力在Transwell(Corning，美國)小室上層涂抹40 μl的基質膠(Corning，美國)，制備2×105/孔的密度、不含血清的A2780細胞懸液，分別給予0、10-8、10-6mol/L TCS刺激，取200 μl滴加于Transwell上室中，下室加入600 μl含10%血清的DMEM培養基。培養24 h后用4%多聚甲醛固定Transwell下層細胞，用0.1%結晶紫染色，后在顯微鏡下觀察計數穿過膜的細胞數。

1.5ERK信號通路驗證實驗 在對A2780細胞進行TCS暴露前，用50 μmol/L的ERK抑制劑PD98059預處理細胞24 h。

1.6Western印跡測定蛋白表達水平用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液(碧云天，中國)中冰裂30 min，然后4℃ 15 000 r/min離心收集上清液，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(碧云天，中國)進行蛋白定量，隨后取40 μg總蛋白100℃加熱10 min變性，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，后轉移到聚偏氟甲酸(PVDF)膜(Millipore，美國)上。用封閉液(碧云天，中國)室溫封閉PVDF膜2 h。然后在4℃將膜與以下主要抗體孵育過夜：p-ERK、ERK、p-NF-κB p65、NF-κB p65、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9及GAPDH(以上抗體均購自Cell signaling technology，美國)。以GAPDH作為內參蛋白。孵育后用TBST清洗膜3次，后在室溫下用辣根過氧化物酶(HRP)結合的二抗孵育PVDF膜1 h。使用增強化學發光檢測試劑盒(碧云天，中國)對蛋白熒光信號進行顯像。

1.7統計學分析 使用Graphpad Prism軟件進行t檢驗及單因素方差分析。

2 結 果

2.1TCS對卵巢癌細胞活性的影響 不同濃度TCS(0、10-10、10-9、10-8、10-7、10-6mol/L)暴露24 h對A2780細胞活性(1.00±0.04、1.07±0.05、1.02±0.04、1.04±0.08、1.03±0.10、1.01±0.06)無明顯影響(P>0.05)。從中選擇了10-8和10-6mol/L TCS暴露濃度進行后續實驗。

2.2TCS對卵巢癌細胞遷移和侵襲的影響 與(TCS 0 mol/L)相比，TCS暴露顯著促進A2780細胞發生遷移(均P<0.05)，且TCS 10-8mol/L的促進作用較10-6mol/L更為明顯(P<0.05)。侵襲實驗的結果與劃痕實驗一致(均P<0.05)。見圖1，圖2。

圖1 TCS對卵巢癌細胞遷移的影響(×40)

圖2 TCS對卵巢癌細胞侵襲的影響(結晶紫染色，×100)

2.3TCS誘導卵巢癌細胞表達MMP-2/-9增加 TCS處理可顯著提高MMP-2和MMP-9的蛋白水平(均P<0.05)，且10-8mol/L處理組的促進效果更為明顯(均P<0.05)。見圖3。

圖3 TCS誘導卵巢癌細胞表達MMP-2及 MMP-9增加

2.4TCS通過誘導ERK磷酸化而促進NF-κB活化 TCS處理可顯著促進ERK和NF-κB蛋白發生磷酸化(均P<0.05)。為進一步驗證TCS對ERK/NF-κB信號通路的激活作用，使用ERK/NF-κB抑制劑PD98059預處理A2780細胞，而后暴露于TCS，前者特異性地阻斷ERK/NF-κB磷酸化。見圖4。

圖4 TCS通過誘導ERK磷酸化而促進NF-κB活化

3 討 論

近幾十年來，EDCs及其對腫瘤細胞遷移和侵襲能力的影響越來越受到重視〔12〕。盡管已有研究表明TCS可促進乳腺癌細胞〔13〕和肺癌細胞〔14〕的遷移和侵襲。在卵巢癌中，僅有報道證實TCS可促進卵巢癌細胞增殖，但尚無關于TCS暴露與卵巢癌細胞遷移和信息能力的研究。本研究發現TCS幾乎不影響卵巢癌細胞活性，但顯著增強卵巢癌細胞A2780的遷移和侵襲，這與之前在其他癌細胞系的研究一致。因此，本研究結果提示TCS可能也是一種促進卵巢癌進展的致癌物質。

關于TCS誘導卵巢癌細胞遷移和侵襲的潛在機制研究，首先發現了TCS可促進MMP-2/-9的表達增加。MMP-2/-9是MMPs家族的重要成員，鑒于其具有降解細胞外基質的作用，MMP-2/-9的高表達被證明與卵巢癌的高轉移潛能有關〔15〕。MMP-2/-9在TCS暴露后的表達在其他癌細胞中也有上調，例如乳腺癌細胞〔13〕。本研究發現TCS誘導卵巢癌細胞MMP-2/-9表達增加可能有助于癌細胞遷移和侵襲。

已有研究證實在多種癌細胞中ERK/NF-κB信號通路的激活對于調節MMP-2/-9的活性非常重要〔16〕。本研究結果表明MMP-2/-9的激活趨勢與ERK/NF-κB途徑的激活趨勢一致。既往有研究發現TCS可通過ERK/NF-κB信號途徑發揮作用。如Cheng等〔17〕發現TCS可特異性活化ERK干擾小鼠胚胎干細胞成骨分化；Kim等〔18〕證實TCS可通過活化ERK途徑乳腺癌細胞增殖。本研究結果提示TCS確實通過ERK/NF-κB通路發揮作用。

綜上，TCS暴露可能通過激活ERK/NF-κB信號通路而促進卵巢癌細胞的遷移和侵襲，提示TCS作為潛在的EDC，有可能加速卵巢癌的進展，并對人類健康構成威脅，有必要加以重視。