老年結直腸癌患者組織中長鏈非編碼RNA HAGLR表達及其臨床意義

盛莉 王琳 康延海 陳鄧林 楊生輝 李向璐 李賽 孔燦燦 袁波

(海南省人民醫院 海南醫學院附屬海南醫院 1腫瘤內一科，海南 海口 570311；2心理科；3內鏡診療中心；4胃腸外科)

結直腸癌發病率在我國老年人群惡性腫瘤中位居第三位，死亡率居第五位，是威脅老年人生命健康的主要疾病之一〔1〕。尋找有臨床意義的分子用于結直腸癌的診斷及監測一直是學界關注的熱點，近年來隨著基因調控研究由編碼基因深入到非編碼基因水平，長鏈非編碼RNA在結直腸癌中的作用逐漸被揭示，有望與傳統腫瘤標志物協同從而提高老年結直腸癌的診療水平〔2〕。HAGLR是2017年首次發現的長鏈非編碼RNA，其在食管癌、肝癌及結直腸癌細胞中均表現出促癌活性〔3～5〕，提示其在腫瘤的發生發展中發揮重要作用，有成為腫瘤分子標志物的潛能，但有關其在老年結直腸癌患者中的臨床意義尚未見報道。本研究擬分析HAGLR在老年結直腸癌患者組織中的表達及其與患者預后的關系。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年6月在海南省人民醫院手術的患者組織樣本215例(觀察組)，同期選取年齡及性別與觀察組匹配的患者100例，經結直腸鏡活檢結果為增生性息肉或炎性息肉，手術切除標本及活檢組織標本均使用生理鹽水沖洗后剪碎裝入凍存管，置于-80℃冰箱凍存備用。回顧分析患者臨床資料包括年齡、性別、腫瘤位置、大小、浸潤深度、淋巴結轉移、臨床分期、腫瘤分化程度〔6〕及術前癌胚抗原(CEA)水平，采用電話隨訪或門診復診的方式，自手術當日起進行隨訪，截止時間為2020年6月30日，記錄患者總生存時間(病理確診日期至患者死亡或最后1次隨訪日期)和無復發生存時間(病理確診日期至局部復發或遠處轉移或最后1次隨訪日期)〔7〕。本研究已報本院醫學倫理委員會批準。對照組男72例，女28例；年齡64～75歲，平均(67.8±6.9)歲。觀察組男144例，女71例；年齡61～77歲，平均(68.4±7.5)歲；腫瘤位置：結腸12例，直腸94例；腫瘤大小2.3～6.9 cm，平均(4.5±2.3)cm；浸潤深度：T1 46例，T2 65例，T3 104例；淋巴結轉移：N0 54例，N1 75例，N2 86例；臨床分期：Ⅰ期66例，Ⅱ期37例，Ⅲ期112例；腫瘤分化程度：低分化71例，中分化77例，高分化67例。

1.2納入與排除標準 納入標準：①術前活檢及術后組織病理報告明確為普通管狀腺癌；②接受結直腸癌根治手術且完整切除腫瘤(腫瘤浸潤最深處與切緣軟組織距離>1 mm)；③術前未接受放療、化療、靶向治療和生物治療等輔助治療；④患者神志清楚且積極配合研究；⑤年齡>60歲。排除標準：①術前經CT或磁共振成像(MRI)證實出現遠處轉移；②特殊病理類型如印戒細胞癌、鱗癌、神經內分泌腫瘤等；③接受姑息性切除；④5年內有其他惡性腫瘤既往史者；⑤合并心、肝、腎等重要臟器嚴重功能不全者。

1.3Trizol法 提取總RNA 取100 mg組織加入1 ml Trizol(中國，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號15596026)，制備組織勻漿后轉移至1.5 ml離心管，室溫靜置5 min后加入200 μl氯仿，顛倒混勻后室溫靜置5 min，4℃下12 377 r/min離心15 min，轉移上層水相至新1.5 ml離心管中，加入等體積異丙醇，顛倒混勻后室溫靜置10 min，4℃下12 377 r/min離心10 min，棄上清液，加入1 ml 75%乙醇4℃下9 790 r/min離心5 min清洗2次，棄乙醇留取沉淀，自然晾干10 min后20 μl 焦碳酸二乙酯水溶解沉淀。采用超微量分光光度計(中國，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號NanoDrop2000)測定總RNA濃度及純度，合格RNA樣品A260與A280比值為1.8～2.0。

1.4逆轉錄 cDNA合成根據步驟1.3中總RNA的濃度計算逆轉錄中所需模板RNA體積，使用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(中國，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號K1621)合成cDNA，逆轉錄體系：2 μg總RNA，1 μl逆轉錄引物，2 μl 10 mmol/L dNTP混合物，1 μl 200 U/μl逆轉錄酶，5 μl 5倍逆轉錄酶緩沖液，1 μl 20 U/μl RNA酶抑制劑，并用無RNA酶水將總反應體積補至20 μl。逆轉錄反應條件：25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。

1.5實時熒光定量 PCR采用 TB Green?Fast qPCR Mix(中國，北京，寶日醫生物技術有限公司，貨號RR430S)進行實時熒光定量PCR。PCR體系：10 μl 2×TB Green Fast qPCR Mix，上下游10 μmol/L引物各0.8 μl，0.4 μl 50×ROX，2 μl模板cDNA，6 μl滅菌水。使用7500HT快速實時熒光定量PCR系統(中國，上海，賽默飛世爾科技有限公司，貨號4351107)進行PCR。以GADPH作為內參。PCR反應條件：95℃ 30 s預變性后，95℃ 3 s，60℃ 15 s，40個循環，反應結束后設置熔解曲線分析程序。 所用引物序列如下：HAGLR上游引物5′-GGCTCTTCCCTAATGTGTGG-3′，下游引物5′-CAGGTCCAGCATGAAACAGA-3′；內參GAPDH上游引物5′-GACTCATGACCACAAGTCCATGC-3′，下游引物5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′。每反應設置3個復孔，根據各孔獲得的循環閾值(CT)進行統計結果分析，采用2-ΔΔCT法分析基因表達水平，相對表達的倍數 N=2-ΔΔCT，其中ΔΔCT =ΔCT實驗-ΔCT對照組，ΔCT實驗/對照=CT目的基因-CT內參。

1.6統計學分析 使用SPSS19.0 軟件進行t檢驗、χ2檢驗；使用受試者工作特征(ROC)曲線評估診斷效能；術后生存率用Kaplan-Meier檢驗，曲線差異用對數秩分析，生存率用壽命表法計算。

2 結 果

2.1HAGLR對結直腸癌的診斷效能 觀察組HAGLR表達量及術前CEA水平〔(7.1±5.0)ng/ml〕高于對照組〔(0.6±0.2),(4.2±1.9)ng/ml〕，差異有統計學意義 (P<0.001)，HAGLR對結直腸癌診斷的曲線下面積(AUC)值〔0.890(95%CI0.851～0.923)〕高于CEA〔0.718(95%CI0.665～0.767)〕，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖1。根據ROC曲線確定HAGLR和CEA最佳靈敏度和特異度下截斷值分別為0.86和7.37 ng/ml。HAGLR診斷結直腸癌的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值及正確指數分別為73.5%、91.0%、94.6%、61.5%、0.64；CEA對診斷結直腸癌分別為52.6%、94.0%、95.0%、48.0%、0.47。

圖1 HAGLR診斷結直腸癌的ROC曲線

2.2HAGLR與患者臨床病理特征的關系 根據HAGLR表達水平將患者分為高表達組(HAGLR表達>0.86)128例及低表達組(HAGLR表達≤0.86)87例。高表達組男性比例、淋巴結轉移數、臨床分期及術前CEA水平均高于低表達組，腫瘤分化程度低于低表達組，差異有統計學意義(P<0.05，P<0.001)，見表1。

表1 HAGLR與患者臨床病理特征的關系(n)

2.3HAGLR與患者預后的關系 至隨訪截止日期共失訪18例(8.4%)，其中高表達組10例(7.8)，低表達組8例(9.2%)，隨訪時間12.0～28.5個月，中位隨訪時間15.2個月，全隊列總生存率為81.7%，總生存時間為(23.4±2.7)個月(95%CI：20.5～26.3個月)，其中低表達組為89.8%；高表達組總生存率為73.7%，低表達組總生存時間為(25.0±2.5)個月(95%CI：22.4～28.7個月)，高于高表達組的(22.6±3.4)個月(95%CI：18.9～25.3個月)，差異有統計學意義(P=0.001)；無復發生存率為70.1%，無復發生存時間為(22.1±1.9)個月(95%CI：20.6～24.3個月)，其中低表達組無復發生存率為83.7%，高表達組為56.6%；低表達組無復發生存時間為(24.7±2.2)個月(95%CI：22.1～26.7個月)，高于高表達組的(20.3±2.1)個月(95%CI：17.5～23.9個月)，差異有統計學意義(P=0.017)。

3 討 論

近年來多種長鏈非編碼RNA分子被發現與結直腸癌的病理特征及預后相關，有助于彌補過去CEA診斷敏感性及預后預測效能較差的缺陷〔8～10〕。本研究結果顯示腫瘤患者組織中HAGLR的表達量及術前CEA水平均升高，進一步診斷試驗發現CEA對結直腸癌診斷的特異度較高而靈敏度欠佳，與既往研究結論相符，Peng等〔11〕研究中CEA診斷結直腸癌的特異度和敏感度分別為93.6%和45.6%，略低于本研究，其原因可能在于Peng等〔11〕的研究對象年齡范圍為27～97歲，本研究僅納入了60歲以上的老年患者。HAGLR在與CEA診斷特異度相當的基礎上表現出更高的靈敏度，診斷效能高于CEA。

以往細胞動物實驗研究也證實了HAGLR可促進肝癌細胞的惡性轉化〔4〕，也有研究報道HAGLR在肺腺癌細胞中表現為抑癌表型，提示HAGLR可能在不同腫瘤類型中發揮著不同的功能，有待進一步深入探討〔12〕，而其與腫瘤浸潤深度及腫瘤部位并未見顯著關聯，說明HAGLR可能更傾向于影響腫瘤的分化及轉移而不是其增殖能力。本研究還發現高表達組男性比例更高，其機制尚不明確，推測這可能與其編碼基因所在染色體與Y染色體之間的連鎖有關。

本研究存在以下幾點不足：①由于結直腸癌術后輔助治療方案取決于患者基因多態性且情況復雜，因此本研究未納入術后輔助放化療情況，后續研究有必要將其納入亞組分析〔13〕；②本研究使用組織樣本而不是外周血檢測HAGLR的表達，這主要在于目前技術水平的不足限制了外周血長鏈非編碼RNA的檢出率，有賴于未來基礎科研的進步提高HAGLR臨床應用價值〔14，15〕。