甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌分離鑒定及藥劑篩選試驗

崔一平，彭埃天，凌金鋒，宋曉兵，程保平，陳 霞

（廣東省農業科學院植物保護研究所/廣東省植物保護新技術重點實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】甘蔗（Saccharum offi cinarumL.）是世界上重要的糖料作物及有發展潛力的可再生能源作物，我國是世界上最大的甘蔗生產國之一［1］。近些年來，我國蔗糖產量和食糖消費量已經躍居世界第3 位［2］。在我國，甘蔗種植面積占糖料種植面積的85%以上，產糖量占食糖總產量的90%以上［3-5］。廣東省是繼廣西和云南之后的我國第三大蔗區，90%左右的植蔗區位于粵西地區，珠三角、粵北地區和粵東地區也有零星種植［6］；其中粵西地區主要以種植糖蔗為主，粵東地區則以種植果蔗為主。甘蔗作為用蔗莖腋芽進行無性繁殖的作物，甘蔗種苗是傳播甘蔗病害的主要媒介。因此，及時科學診斷出新的甘蔗種傳病害并提出具體的防治藥劑，有利于增強甘蔗的種苗安全，對提高甘蔗產量和品質有重大的研究意義。【前人研究進展】在我國，甘蔗上報道的病害如甘蔗黑穗病、甘蔗花葉病、甘蔗宿根矮化病、甘蔗黃葉綜合征和甘蔗鳳梨病等大約有50 多種，這些病害大多數都能夠通過種苗進行傳播［7-9］。同時，由于蔗區之間引種頻繁、蔗種相互調換，缺乏檢測，使得一些嚴重病害在甘蔗種植區造成了嚴重為害，如印度，赤腐病已經對甘蔗產業造成了毀滅性的打擊［10］。近年來，越來越多的新病害在我國不同的蔗區被報道，如由Fusarium sacchari引起的甘蔗萎蔫病，Fusarium commune引起的甘蔗根腐病，Alternaria tenuissima引起的甘蔗葉片白條病等等［11-13］。這些新病害的出現極大增加了甘蔗病害防治的難度，給不同種植區間甘蔗的引種增加了風險。【本研究切入點】甘蔗黑斑霉葉條病為本課題組2016 年和2017 年在廣東省廣州市南沙區田間的黑皮果蔗上發現，病害初期在甘蔗幼嫩葉片的葉緣上出現黃色到白色的條狀病斑，而后逐漸向葉片的中脈進行擴展；發展到后期嚴重的時候，從葉鞘外可看到粉色的水漬狀病斑，葉鞘的顏色由淡綠色變為粉色。經過調查發現，甘蔗黑斑霉葉條病在甘蔗的苗期到成株期均可發生危害；一旦環境合適，在苗期甘蔗黑斑霉葉條病可造成甘蔗植株的大面積干枯死亡；而在甘蔗生長的后期發病，則會造成甘蔗頂梢葉片的大量枯死，從而嚴重影響甘蔗的光合作用，造成甘蔗糖分積累的大量減少。【擬解決的關鍵問題】本研究著重對引起甘蔗黑斑霉葉條病病原菌Nigrospora sphaerica進行分離鑒定，同時對其生長溫度、pH、檢測及化學藥劑防治進行研究和篩選。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物：感病和健康的黑皮果蔗于2017年采集自廣州市南沙的甘蔗種植地（種植面積為5 153.3 hm2）。培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、去離子水定容至1 000 mL）。

試劑及儀器：Axygen 動植物基因組DNA制備試劑盒，愛思進生物技術（杭州）有限公司；PCR 擴增試劑盒2×EasyTaq PCR SuperMix（-dye），北京全式金生物技術有限公司；研究中用到的引物合成及PCR 產物測序服務均購自上海生工生物工程有限公司；1 mol/L NaOH（4 g NaOH 加入到100 mL 水中），1 mol/L HCl（1 mL 37%濃鹽酸加入到11 mL 水中）。美國貝克曼Microfuge 20 微量離心機、T100TM PCR 儀及美國伯樂1704487 小型水平電泳槽均購自上海凌儀生物科技有限公司；生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司；Leica DM2500 光學顯微鏡，德國Leica 公司。

化學藥劑：施保功（Sporgon），為丙氯靈prochloraz 和氯化錳復合制成的50%可濕性粉劑，德國先靈農業化學有限公司獨立開發的咪唑類廣譜性殺菌劑，對子囊菌引起的各種作物病害有特效。苯醚甲環唑（Difenoconazole），別名世高，有多種劑型，內吸性殺菌，具保護和治療作用，對很多作物上的真菌病害都有保護和治療作用。苯甲·福美雙，為苯醚甲環唑和福美雙進行有機配合制成的60%可濕性粉劑，由山東東泰農化有限公司研發制成，對水稻、煙草和蔬菜等真菌性病害有特效。咪鮮胺（Prochloraz），是一種廣譜殺菌劑，需避光保存，是德國艾格福公司（現為拜耳公司）于1977 年開發的咪唑類廣譜性殺菌劑，對多種作物由子囊菌和半知菌引起的病害具有明顯的防效，也可以與大多數殺菌劑、殺蟲劑、除草劑混用，均有較好的防治效果。50%丙環唑，是一種廣譜、內吸性的葉面殺菌劑，由江西正邦生物化工股份有限公司研制，對水稻和小麥紋枯病、香蕉黑星病、水稻稻曲病等都有良好防效。噻唑鋅，購自浙江新農化工股份有限公司，為懸浮劑，對細菌性病害特效，對多種真菌性病害高效。噁霉靈（hymexazol），為內吸性殺菌劑、土壤消毒劑和植物生長調節劑，購自北京為民生物科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌分離及形態特征觀察 選取感病的黑皮甘蔗葉片和葉鞘，用剪刀在病健交界處剪出0.2 mm×0.2 mm 左右的正方形小塊，然后依次在70%酒精中放置30 s,2%NaClO 1.5～2 min，無菌水沖洗4 次，置于無菌濾紙上在超凈臺中晾干，最后放置于PDA 培養基上25 ℃進行暗培養。

1.2.2 致病性測定 選取在PDA 上培養7 d 的分離菌株,菌絲塊大小為5 mm×5 mm，分別接種于帶有傷口的1 月齡甘蔗苗上；同時以相同的PDA培養基塊接種于帶傷口的黑皮甘蔗莖稈上，作為陰性對照。

采集健康和發病的甘蔗作為種子，分別種植于已滅菌的土壤中，放置于恒溫培養箱中28 ℃培養（光照/黑暗：12 h/12 h；濕度：40%）；正常肥水管理，20 d 后觀察甘蔗苗的生長狀態。

1.2.3 分離菌株的分子生物學鑒定 將培養7 d的分離菌株菌絲從PDA平板上刮下來，迅速用液氮研磨。然后依據Axygen動植物基因組DNA制備試劑盒說明書進行DNA提取。選取核糖體轉錄間隔區（ITS）的檢測引物（ITS1：5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'和ITS4：5'– TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）［14］，分別以分離菌株的全基因組DNA為模板進行PCR擴增。對所得到的PCR產物在1 %的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，將獲得的陽性PCR產物送去測序。對獲得的片段核酸信息在NCBI中進行BLAST并把相關數據提交到NCBI數據庫，同時利用MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大似然法建立進化樹，從而確定該分離菌株的分類地位。

1.2.4 甘蔗組織DNA 的提取 稱取新鮮組織 4～5 g，剪碎放入研缽中，用液氮研磨成粉末；將粉末轉移到已滅菌的2 mL 離心管中，根據Axygen 動植物基因組DNA 制備試劑盒說明書進行操作，并在1%瓊脂糖凝膠上對所獲DNA 進行電泳檢測。

1.2.5 甘蔗黑孢霉葉斑病的檢測 根據以ITS1/ITS4 為引物，甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌N.sphaerica的D N A 為模板，擴增獲得的ITS序列設計特異性的檢測引物。通過NCBI的Primer-blast設計2對引物；Ns1F:5-TGTACCTGCGGAGGGATCAT-3和Ns2R:5-CCTGATCCGAGGTCAACCAG-3,PCR產物為501 bp；Ns2F:5-GAACGCAGCGAAATGCGATA-3和Ns2R：5-ACTACGCTCAG AGGACTGCT-2，PCR產物為206 bp。分別以采集自田間發病植株的葉片和葉鞘，人工接種發病植株的葉片以及N.sphaerica菌落的DNA為模板進行PCR反應，PCR反應流程為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸60 s，34個循環；72℃延伸10 min；取5 μL PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測；同時將獲得的陽性PCR產物測序，確定擴增的準確性。

1.2.6 菌株S2-1 生物學特性的測定 溫度對菌株S2-1 菌絲生長的影響：在單胞培養7 d 的N.sphaerica菌落上，用滅菌打孔器取直徑5 mm的菌餅分別接種在PDA 平板中央，每塊平板上放1 個，分別放在5、10、15、20、25、30 ℃培養箱中，每個處理3 次重復。同時，分別在接種后1、2、3、4 d 用十字交叉法測量菌落生長直徑并記錄。

pH 對S2-1 菌絲生長的影響：用1 mol/L NaOH 和1 mol/L HCl 分別調節滅菌的PDA 培養基，pH 分別調節為4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、8、9。取單胞培養7 d 的N.sphaerica菌落上直徑5 mm 的菌餅，分別接種在調好pH 的平板上，每個處理3 次重復。接種后，把平板放入28 ℃培養箱中進行暗培養，接種后5 d 用十字交叉法測量菌落生長直徑并記錄。

1.2.7 7 種殺菌劑對N.sphaerica（S2-1）的抑制率測定 通過菌絲生長速率測定法［15］，在PDA培養基中分別加入濃度為5、15、25、35、45、55 mg/L 的苯醚甲環唑,0.05、0.1、0.25、0.5、1、2 mg/L 的50%丙環唑,0.18、0.35、0.7、1.4、2.8、5.6 mg/L 的苯甲·福美雙,0.005、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L 的咪鮮胺,0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.2、2.4 mg/L的施保功,2.5、5、10、15、20、25、35 mg/L的噻唑鋅,2.5、5、10、15、20、25 mg/L 的噁菌靈制成含藥培養基；然后在培養7 d 的N.sphaerica菌落上用滅菌打孔器取直徑為5 mm 菌餅，將菌餅生長菌絲的一面朝下接種在各含藥培養基和空白PDA 培養基平板中央（每個平板接種1 個菌餅），每個處理3 次重復，并放置在28 ℃恒溫培養箱中進行暗培養；然后在培養3、4、5、6 d 采用十字交叉法分別測量菌落直徑并記錄，每個處理4 次重復，計算不同處理對菌絲生長的抑制率：

試驗數據采用Excel 2010 進行處理，采用DPS2005 軟件進行數據統計分析，應用Duncan氏新復極差法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 甘蔗黑孢霉葉斑病及其病原菌特征

從發病的黑皮甘蔗葉片和葉鞘上分離獲得6株分離菌株，其中1 株與其他分離株的菌落形態均不一樣；我們把這株不一樣的分離菌株命名為S1，其他分離菌株編號為S2-1～S2-5，其中S2-1～S2-5 在菌落形態和培養特性方面均一致。S1在PDA 上培養7 d 后的菌落形態為圓形，中心淡紫色，其他部位為白色；在顯微鏡下觀察，其有大、小2 種孢子，大孢子為明顯的鐮刀狀，小孢子為卵圓形（圖1A、D）。S2-1～S2-5 在PDA 培養基上培養3～4 d 后，菌落圓形，顏色從中央依次為黑色、黃色和白色（圖1B）；培養7 d 后，隨著色素的積累，整個菌落呈現黑色（圖1C）。本試驗選取S2-1 為代表菌株，S2-1 的菌絲有分隔和分叉，白色和黑色；分生孢子單生、頂生，單孢球形或近球形，黑色，表面光滑，直徑10.2～15.8 μm（圖1E）。根據病原菌的形態特征及培養性狀，初步判斷S1 為鐮刀菌屬真菌，S2-1～S2-5 為球黑孢病菌Nigrospora sphaerica（Sacc.）Mason［16］。

圖1 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的分離及分子鑒定Fig.1 Isolation and molecular identification of the pathogen of sugarcane Nigrospora blight

2.2 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的致病性測定和分子生物學鑒定

為進一步明確甘蔗黑孢霉葉斑病的病原菌，分別對S1 和S2-1 在甘蔗上進行致病性測定。結果（圖2）表明，S1 在甘蔗上不具有致病性，S2-1 能夠在甘蔗上引起與田間相似的病害癥狀。同時，以帶菌的甘蔗莖稈和健康甘蔗莖稈為種子種植在滅菌土壤中，放置于28 ℃培養箱內和田間，均進行正常的肥水管理；1 個月后，以帶菌甘蔗莖稈為種子長出的甘蔗苗葉片從葉尖到葉基表現出明顯的白條癥狀；在田間的試驗中也表現出相同的癥狀。而以健康甘蔗莖稈為種子長出的甘蔗苗則沒有表現出任何癥狀。再次對這些發病甘蔗苗進行病原菌分離仍然能夠獲得與S2-1 菌落形態和生物學特性相一致的病原菌。以上結果表明，甘蔗黑孢霉葉斑病為甘蔗的種傳病害。

圖2 菌株S2-1 在甘蔗上的致病性測定Fig.2 Pathogenicity determination of strain S2-1 on sugarcane

利用真菌ITS 序列通用引物對菌株S2-1 的DNA 擴增，獲得大小約為580 bp 的片段。將該ITS 序列進行測序，并將序列提交至NCBI，經BLAST比對發現，S2-1 的ITS（登錄號：MW832509）與來自N.sphaericaPTA1 的ITS（登錄號：KM893076.1）在序列的相似性和覆蓋性上均為100%。同時通過MegAlign 7.1.0（44）軟件以最大似然法建立菌株S2-1 的系統發育樹發現，S2-1 與黑孢霉菌株PTA1 在一個分支上，而與N.oryzaeBY-D（KF924041）和N.osmanthiCOL2（MH645207）的親緣關系較遠。根據菌株S2-1的形態學特征以及分子生物學鑒定結果，甘蔗黑孢霉葉斑病的病原菌鑒定為球孢霉菌N.sphaerica（圖3）。

圖3 基于ITS 序列以最大似然法構建菌株S2-1 與Nigrospora sp.其他種的進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain S2-1 and Nigrospora sp. based on ITS sequence with maximum likelihood method

2.3 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的檢測

通過PCR 檢測，結果表明，Ng1F/ Ng1R 能夠對帶有甘蔗黑孢霉葉斑病的甘蔗病樣及其病原菌N.sphaerica進行有效擴增（圖4A），而Ng2F/ Ng2R 則不能夠對以上甘蔗病樣進行有效擴增。因此Ng1F/ Ng1R 可以作為檢測甘蔗黑孢霉葉斑病的檢測引物。

2.4 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的生物學特性

2.4.1 溫度對S2-1 菌絲生長的影響 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌S2-1 對溫度的適應范圍較廣，在10～30 ℃范圍內，S2-1 均能生長。但當溫度為5 ℃時，菌絲停止生長；而當溫度高于30 ℃時，菌絲生長速率明顯下降。最適生長溫度為25 ℃，其次為20 ℃（圖4B）。當溫度為25 ℃時，菌落生長速率最快；培養4 d 后，菌落直徑已經達到80 mm，且與20 ℃和30 ℃之間的差異明顯（圖4B）。

2.4.2 pH 對S2-1 菌絲生長的影響 甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌S2-1 對酸堿度適應范圍較廣，在pH 為4～8 范圍內均可以正常生長。但以pH7 時菌落生長速率最快，培養4 d 后平均菌落直徑為80 mm；隨著pH 升高，菌絲生長速度開始下降。當pH 為9 時，菌絲停止生長（圖4C）。

圖4 Nigrospora sphaerica 的檢測電泳及其在不同溫度和pH 條件下的菌落生長直徑Fig.4 Detection electrophoresis of Nigrospora sphaerica and its colony growth diameter on PDA plate under different temperatures and pH

2.5 甘蔗黑孢霉葉斑病菌室內最佳防治藥劑篩選

咪鮮胺對甘蔗黑孢霉葉斑病菌的抑菌效果最好，最高可達到98%；苯醚甲環唑和施保功的抑菌效果次之，最高可達到90%和93%；50%丙環唑、苯甲·福美雙和噁菌靈的防治效果較差，最高在70%～81%之間；而噻唑鋅則完全沒有抑菌效果（圖5 和表1）。因此，在對甘蔗黑孢霉葉斑病進行防治時可優先選用咪鮮胺，也可選用苯醚甲環唑和施保功進行交叉使用。

表1 共培養6 d 后7 種殺菌劑對Nigrospora sphaerica 在PDA 平板上菌落生長的抑制作用Table 1 After co-cultivate 6days,indoor inhibition effect of 7 fungicides on the growth of conloy of Nigrospora sphaerica on PDA

圖5 7 種殺菌劑對Nigrospora sphaerica 在PDA 平板上生長的影響Fig.5 Effects of 7 fungicides on the growth of Nigrospora sphaerica on PDA plates

為了選出不同殺菌劑在室內抑制甘蔗黑孢霉葉斑病菌生長效果最佳的使用濃度，通過對以上供試藥劑梯度濃度（具體濃度見1.2.7）進行抑菌測定實驗發現：咪鮮胺的抑菌濃度最低，抑菌效果最好，在0.16 mg/L 時抑菌效果達到98%；其次是施保功，在2.4 mg/L 時抑菌效果達到93%，而苯醚甲環唑在濃度為35 mg/L 時抑菌濃度最高為90%，其他藥劑的防治效果均不理想。因此在防治甘蔗黑孢霉葉斑病時推薦使用0.16 mg/L 咪鮮胺藥劑和2.4 mg/L 施保功藥劑。

3 討論

種苗安全對甘蔗的安全生產有著極其重要的作用。本研究中，甘蔗黑孢霉葉斑病為甘蔗上新發現的種傳病害，由黑孢霉N.sphaerica引起；該病害為本課題組2016 年和2017 年在廣東省廣州市南沙區田間的黑皮果蔗上發現［17］。甘蔗黑孢霉葉斑病在甘蔗成株期發病時，主要影響甘蔗糖分的積累；但是在甘蔗幼苗期發病時會造成甘蔗植株的整株枯死，而且一旦種莖帶病，長出的苗子則100%帶病。甘蔗黑孢霉葉斑病嚴重影響甘蔗的產量和質量。

近年來越來越多關于N.sphaerica引起病害的報道，如在印度的茶葉、中國的茶花和青錢柳上引起黑孢霉葉斑病等［16,18-20］。但關于N.sphaerica引起甘蔗黑孢霉葉斑病及其病原菌的生物學特性還是首次報道。過去甘蔗病害的防治主要以培育抗病品種為主，輔助以化學藥劑防治和栽培管理（如種植密度、種植方式及肥水管理等）［21-22］；但對于種傳甘蔗病害則首先是加強引種檢疫，并多采用與其他作物進行輪作、種植無病種苗及改變施肥模式等［2,23-24］。甘蔗作為用蔗莖腋芽進行無性繁殖的作物，由于多年反復種植，極易受到種苗傳播病原的反復侵染，而且一旦侵染，將會給甘蔗產量和質量造成極大損失。研究者們在脫毒健康種苗的生產方面采用了各種方法，如熱蒸汽消毒種苗、熱水浸種消毒以及后來的熱水浸種消毒結合組織培養脫毒技術；同時通過建立三級苗圃制來進一步杜絕危險性病害的蔓延，保證種苗的健康［25-26］。通過研究發現，N.sphaerica的最適生長溫度為25 ℃，最適pH 為7，因此也可通過以上方法對種苗進行脫毒處理。此外，也有研究表明甘蔗間套種綠豆可通過改善土壤環境提高甘蔗的產量和品質［27-29］；同時通過7 種不同殺菌劑對N.sphaerica的抑菌性測定發現，咪鮮胺和施保功可用以對甘蔗蔗種進行浸種處理或在甘蔗下種前，與細土混合后撒施在甘蔗基部。而在過去也有報道咪鮮胺和苯醚甲環唑在甘蔗病害的防控上發揮重要作用，如咪鮮胺和苯醚甲環唑對甘蔗褐條病有明顯的防治效果，但苯醚甲環唑對甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的室內毒力測定效果則欠佳［30］。

4 結論

引起種傳病害甘蔗黑孢霉葉斑病的病原菌為N.sphaerica，引物Ng1F/ Ng1R 可以作為田間和室內對甘蔗黑孢霉葉斑病病原菌的檢測；通過對N.sphaerica的生物學特性研究發現，該菌的最適生長溫度為25 ℃，最適生長pH 為7；咪鮮胺藥劑0.16 mg/L 和施保功藥劑2.4 mg/L 對N.sphaerica的抑菌效果最顯著，抑菌效果均可達到93%以上，推薦這2 種藥劑作為甘蔗蔗種處理和田間施用藥劑。化學藥劑防治僅是防治甘蔗黑孢霉葉斑病發生的一個措施，最有利的防治手段還是加強甘蔗的種苗檢測，尤其是在引種時和蔗區調種時。