穴位埋線對變應性鼻炎大鼠炎癥介質、細胞因子及JNK通路的調節作用?

鄭曉娟， 張艷梅， 王曉燕

(河南中醫藥大學鄭州市中醫院， 鄭州 450000)

變應性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是臨床常見的變態反應性疾病，其病因是機體接觸過敏原后免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)大量釋放并介導鼻黏膜中炎癥反應激活[1]，IgE釋放后與其受體結合后能夠促進嗜酸性粒細胞趨化蛋白(eotaxin)釋放，引起多種細胞因子分泌異常，進而引起鼻黏膜發生病理改變，同時也加重鼻黏膜中體液免疫應答的紊亂[2-3]。c-Jun氨基末端激酶(c-Jun amino-terminal kinase，JNK)是絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族中的重要成員之一。該通路的激活參與哮喘、AR等多種過敏性疾病的發病。

AR屬于中醫“鼻鼽”范疇，該病氣陽虛衰為本、外感風邪為標，治療應以升陽益氣、健脾益氣為主[4-5]。穴位埋線是以針灸經絡理論為指導的中醫治療手段。已有研究報道，選取百會、肺俞、脾俞3個穴位進行埋線是治療AR的有效手段[6-7]。為闡明穴位埋線治療AR的機制，本研究以AR模型大鼠為實驗對象，觀察了穴位埋線對AR大鼠炎癥介質、細胞因子及JNK通路的影響，旨在進一步明確穴位埋線治療AR的作用，并探討介導這一作用的分子機制，為穴位埋線臨床治療AR提供理論基礎。本研究已通過河南中醫藥大學實驗動物倫理委員會審查，批號V20200908。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠，6～8周齡，體質量140～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物合格證號SCXK(滬)2017-0005，飼養在河南中醫藥大學動物中心，溫度18～25 ℃，適度50%～60%，自由光照。

1.2 試劑與儀器

卵清蛋白(貨號O1641、5 mg/支)，Sigma公司；氫氧化鋁(貨號A800852、500 g/瓶)，上海麥克林生化科技有限公司；丙酸倍氯米松(貨號5534-09-8、1000 g/瓶 )，武漢澤諾生物科技有限公司；4-0醫用羊腸線，上海浦東金環醫療用品股份有限公司；HE染色試劑盒(貨號ZLI-9018)，北京中杉金橋生物公司；IgE(貨號F15751)、Eotaxin(貨號F15330)、干擾素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(貨號F15730)、白介素(interleukin)-4(貨號F15850)、IL-5(貨號F15860)、IL-17(貨號F15940)酶聯免疫吸附檢測(ELISA)試劑盒，上海西唐公司；JNK、p-JNK的單克隆一抗(貨號9252)，CST公司；顯微鏡，日本尼康公司；凝膠成像系統，上海天能公司。

1.3 模型制備與分組

實驗動物隨機分為對照組和造模組，對照組共10只，造模組參照田永萍等[7]研究按照下列方法制備AR模型。第1～14天，腹腔注射含有0. 3 mg卵清蛋白及30 mg氫氧化鋁的0.9%氯化鈉溶液1 mL，隔日1次共7次，該階段為致敏階段；第15～21天，用0.9%氯化鈉溶液配置含有2%卵清蛋白的混懸液，雙側鼻孔各滴入0.05 mL，每日1次，連續7次，該階段為激發階段。完成造模后，參照田永萍等[7]研究對鼻癢、噴嚏、清涕的癥狀進行評分。鼻癢：輕擦鼻幾次為1分，抓撓鼻、面不止，到處摩擦為2分；噴嚏：1～3個為1分，4～10個為2分，11個及以上為3分；清涕：流涕至前鼻孔為1分，流涕過前鼻孔為2分，流涕滿面為3分，總得分超過5分為造模成功。將造模成功的30只大鼠進一步隨機分為模型組、西藥組、埋線組每組各10只，第22天開始對各組大鼠進行干預共治療4周。

1.4 各組處理方法

西藥組給予丙酸倍氯米松雙側滴鼻(0.18 mg/kg)，每日1次，連續4周。埋線組分2階段進行穴位埋線治療：第一階段為第1～2周，選擇“百會”、雙側“肺俞”穴埋線1次；第二階段為第3～4周，選擇“百會”“肺俞”“脾俞”穴埋線1次。穴位根據《實驗針灸學》[8]的大鼠穴位圖譜，“百會”在頂骨正中，用9號埋線針向前或后斜刺2 mm；“肺俞”為第三胸椎棘突下兩旁肋間，直刺5 mm，“脾俞”為第十二胸椎下兩旁肋間，直刺5 mm。確定穴位后，對穴位及周圍皮膚進行消毒，用9號埋線針將4-0羊腸線埋入，埋線長度約2～3 mm。對照組及模型組不進行特殊處理。

1.5 觀察指標及檢測方法

治療結束后，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/kg麻醉后，經心臟負壓采血5～6 mL，離心后收集血清，采用ELISA試劑盒檢測IgE、Eotaxin、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的含量，操作均按照試劑盒說明書進行。頸椎脫臼處死大鼠，打開鼻腔并解剖鼻黏膜組織，0.9%氯化鈉溶液清洗后分為兩份，一份用4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，用于HE染色并在顯微鏡下觀察病理改變。另一份用液氮冷凍后加入RIPA裂解液提取蛋白，采用ELISA試劑盒檢測IgE、Eotaxin、IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17的含量，按照試劑盒說明書進行操作。另取組織蛋白適量，蛋白樣本在凝膠電泳系統內進行電泳、電轉硝酸纖維素(NC)膜，5%脫脂牛奶封閉后孵育JNK、p-JNK及β-actin的一抗，4 ℃過夜。次日，孵育HRP二抗，室溫1～2 h，在凝膠成像系統顯影，以β-actin為內參，根據蛋白條帶的灰度值計算表達水平。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 各組大鼠癥狀評分及鼻黏膜病理切片HE染色比較

表1顯示，模型組大鼠癥狀評分增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。干預后，西藥組、埋線組大鼠癥狀評分較干預前降低，且癥狀評分低于模型組，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；與西藥組比較，埋線組大鼠癥狀評分差異無統計學意義(P>0.05)，提示西藥及埋線治療干預均能改善AR癥狀，且西藥與埋線效果相當。

表1 各組大鼠癥狀評分比較

圖1顯示，對照組大鼠鼻黏膜形態正常，無炎癥細胞浸潤；模型組大鼠鼻黏膜可見組織水腫充血明顯，大量炎癥細胞浸潤；西藥組、埋線組大鼠鼻黏膜可見組織水腫充血改善，炎癥細胞浸潤減少，提示模型組大鼠出現了AR相關的病理改變，穴位埋線及西藥均能夠改善AR的病理改變。

注：箭頭所指為浸潤的炎癥細胞

2.2 各組大鼠血清及鼻黏膜中炎癥介質比較

表2示，模型組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。干預后，西藥組、埋線組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)；與西藥組比較，埋線組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量差異無統計學意義(P>0.05)，提示西藥及埋線治療干預均能抑制模型大鼠炎癥介質Eotaxin、IgE的分泌，且西藥與埋線的效果相當。

表2 各組大鼠血清及鼻黏膜中Eotaxin、IgE含量比較

2.3 各組大鼠血清及鼻黏膜中細胞因子比較

表3顯示，模型組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量減少，IL-4、IL-5、IL-17的含量增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。干預后與模型組比較，西藥組、埋線組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量增加(P<0.01)，IL-4、IL-5、IL-17的含量降低(P<0.01)；與西藥組比較，埋線組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17含量差異無統計學意義(P>0.05)，提示西藥及埋線治療干預均能調節模型大鼠細胞因子的分泌，且西藥與埋線的效果相當。

表3 各組大鼠血清及鼻黏膜中IFN-γ、IL-4、IL-5、IL-17含量比較

2.4 各組大鼠鼻黏膜中p-JNK、JNK表達的比較

圖2表4顯示，各組間JNK的表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。模型組大鼠鼻黏膜中p-JNK的表達水平增加，與對照組比較差異有統計學意義(P<0.01)。干預后與模型組比較，西藥組鼻黏膜中p-JNK的表達水平無明顯變化(P>0.05)，埋線組大鼠鼻黏膜中p-JNK的表達水平降低(P<0.01)。

圖2 各組大鼠鼻黏膜中p-JNK及JNK的蛋白條帶

表4 各組大鼠鼻黏膜中p-JNK、JNK表達水平比較

3 討論

穴位埋線屬于通過局部埋入羊腸線來對穴位產生物理及生化刺激，進而通過經絡將刺激傳入體內，最終起到治療疾病的作用。AR屬于中醫理論“鼻鼽”范疇，其病機在于肺脾腎功能失調，針對病機選擇百會肺俞脾俞穴進行針灸或埋線可以起到治療作用[9-10]。本研究在AR大鼠中選擇“百會”“肺俞”“脾俞”3個穴位進行埋線治療。

AR的病理本質是IgE介導的鼻黏膜炎癥反應，已有多項AR相關的動物研究采用鼻黏膜HE染色病理改變評價不同手段治療AR的療效，認為通過HE染色觀察病理改變具有直觀性及客觀性均較強的優點[11-12]。本實驗觀察到，模型組大鼠的鼻黏膜出現了水腫充血、炎癥細胞浸潤等典型的AR病理改變；在穴位埋線及西藥治療后，AR的病理改變均明顯改善，因此筆者認為穴位埋線用于AR治療能夠減輕鼻黏膜損傷，抑制炎癥細胞浸潤。

本研究通過HE染色觀察鼻黏膜的病理改變后，還通過分子生物學實驗方法檢測參與AR病理改變的多種分子變化，以此進一步確認穴位埋線治療AR的價值。IgE介導炎癥反應激活在AR發病中起重要作用，接觸過敏原后IgE的大量釋放能夠引起嗜酸性粒細胞向鼻黏膜遷移、浸潤，進而釋放炎癥介質Eotaxin來介導炎癥反應，引起黏膜損傷。在HE染色中已經觀察到，模型大鼠鼻黏膜中有嗜酸性粒細胞的大量浸潤，進一步觀察炎癥介質IgE及Eotaxin的變化，發現模型組血清及鼻黏膜中IgE、Eotaxin的含量均增多，而西藥組和埋線組血清及鼻黏膜中IgE、Eotaxin的含量均減少，且2組間IgE、Eotaxin比較無差異。因此筆者認為，穴位埋線用于治療AR能夠抑制炎癥反應，且抑制作用與西藥相當。

已有多項研究證實，Th1、Th2、Th17失衡與AR發病有關，相應細胞因子在AR發病過程中也出現了改變[13-15]。在過敏原刺激IgE釋放的過程中，Th1產生的細胞因子IFN-γ介導細胞免疫應答并抑制IgE的釋放，Th2產生的細胞因子IL-4、IL-5介導體液免疫應答并促進IgE的釋放；同時，IgE還能招募Th17細胞不斷浸潤并分泌IL-17，進而起到趨化作用并加重鼻黏膜的病理改變[13-15]。本研究對AR模型大鼠上述細胞因子的分析與既往其他學者[13-15]的研究一致，即模型組血清及鼻黏膜中IFN-γ的含量降低，IL-4、IL-5、IL-17的含量增多；而在治療后，西藥組及埋線組的上述細胞因子均明顯改善。因此筆者認為，穴位埋線用于治療AR能夠調節多種細胞因子的釋放，且調節作用與西藥相當。

在穴位埋線用于非酒精性脂肪肝大鼠治療的實驗中，穴位埋線被證實能夠通過抑制JNK通路的激活來改善胰島素抵抗及炎癥反應[16]，提示JNK通路可能是穴位埋線發揮治療作用的靶點。JNK通路是調節炎癥反應與免疫應答的重要信號通路，信號分子JNK發生磷酸化是信號通路激活的方式，表現為p-JNK表達增加。陳超蕾等研究證實，在脂多糖誘導的肺組織炎癥中，JNK通路的激活與多種ILs的異常分泌有關[17]；肖文艷等研究證實，在金葡菌刺激巨噬細胞活化的過程中，JNK通路的激活介導了IL-5的分泌[18]；Xiong Y等研究證實，在氣道過敏小鼠中，JNK通路的激活能刺激Eotaxin的釋放[19]。本實驗對JNK通路的分析結果與既往研究報道一致，即模型組鼻黏膜中p-JNK的表達增多；進一步分析治療后JNK通路的變化可知，埋線組鼻黏膜中p-JNK的表達減少，而西藥組鼻黏膜中p-JNK的表達無明顯變化。結合既往其他學者報道JNK通路對IL-5、Eotaxin等的調控作用，筆者認為穴位埋線治療抑制炎癥介質釋放、調節細胞因子釋放的作用與抑制JNK通路激活有關，但其具體的分子機制仍有待進一步研究的加以驗證。