太芪培元顆粒對免疫低下小鼠T細胞亞群、NK細胞計數及巨噬細胞吞噬作用的影響研究?

曾 琳， 馬秀蘭△， 馬建萍， 李靜茹， 張 穎， 艾合買提·阿布都熱依木

(1.新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院艾滋病研究室， 烏魯木齊 830000；2.新疆名醫(yī)名方與特色方劑學實驗室， 烏魯木齊 830000)

艾滋病又稱獲得性免疫缺陷綜合征(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一種由人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)引起的、以全身免疫系統(tǒng)嚴重損害為特征的傳染性疾病。太芪培元顆粒是新疆醫(yī)科大學附屬中醫(yī)醫(yī)院的院內制劑，用于治療氣陰兩虛、肺腎不足型的艾滋病患者。該藥物自2008年起開始在臨床應用，通過臨床療效觀察，該方可以明顯改善患者癥狀體征，提升部分患者的CD4+T細胞水平，提高生存質量[1-5]。觀察太芪培元顆粒對免疫低下小鼠外周血T細胞亞群含量、自然殺傷細胞(NK)計數及巨噬細胞吞噬作用的影響，初步探索該藥可能的作用機制。本研究已獲新疆醫(yī)科大學實驗動物倫理審查委員會批準，批準號2018-0013-01。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF級雄性BALB/c小鼠120只，每只18～22 g，由新疆醫(yī)科大學動物實驗中心提供，實驗動物許可證號SYXK(新)2018-0003。飼養(yǎng)期間室內溫度22 ℃，濕度58%～70%之間，喂飼輻照滅菌BALB/c小鼠飼料，給藥前禁食12 h，自由飲水。

1.2 藥物制備

太芪培元顆粒用水煎、醇沉等現代工藝和方法制成浸膏，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院藥劑室提供；黃芪顆粒(4 g×12袋，四川百利天恒藥業(yè)股份有限公司，國藥準字Z20003380)；環(huán)磷酰胺(0.2 g×10瓶，山西普德藥業(yè)股份有限公司，國藥準字H14023686)。

1.3 試劑與儀器

甲醇-丙酮固定液(1∶1，批號G2155)，索萊寶公司；吉姆薩染液(10×原液，批號G1015)，索萊寶公司；紅細胞裂解緩沖液(RBC Lysis Buffer)(1×)、溶血素,eBioscience公司；PE anti-mouse CD49b,pan-NK cells公司；FITC anti-mouse CD3、PerCP anti-mouse CD8a、APC anti-mouse CD4，biolegend公司。

LC-4016低速大容量離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)；BriCyte E6流式細胞儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；Axio Observer A1熒光倒置顯微鏡(德國蔡司公司)；BSC-150恒溫恒濕箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠)；XS-800i全自動血液分析儀(日本 Sysmex 公司)。

1.4 動物模型建立

雄性實驗小鼠120只，動物適應性飼養(yǎng)1周。其中20只小鼠正常飼養(yǎng)為對照組；其余100只小鼠均采用每只每天腹腔注射25 mg環(huán)磷酰胺注射液進行造模；連續(xù)腹腔注射7 d后，隨機取空白對照和模型對照各10只，測血常規(guī)、脾臟和胸腺指數，以檢測造模成功與否。在灌服藥物期間，每周小鼠腹腔注射一次20 mg環(huán)磷酰胺注射液，以維持免疫低下狀態(tài)。

1.5 分組與給藥

將造模成功的90只小鼠隨機分為模型組、黃芪顆粒組、太芪培元顆粒高劑量組、太芪培元顆粒中劑量組、太芪培元顆粒低劑量組5組各18只。按照“實驗動物與人按體表面積比等效劑量換算比率表”[6]，計算小鼠每日給藥劑量。依據人體質量(60 kg)與實驗小白鼠體表面積比換算和設定為小鼠的太芪培元顆粒中劑量。造模成功后開始給藥，具體給藥方式為：正常組、模型組小鼠給予等量生理鹽水進行灌胃；中藥對照組黃芪顆粒用雙蒸水配成溶液，使用13.3 mg·kg-1·d-1水溶液進行灌胃；藥物干預高、中、低劑量組大鼠給予太芪培元顆粒水煎液灌胃，劑量分別為33.26、16.63、8.32 g·kg-1·d-1，每日灌胃1次，連續(xù)28 d。

1.6 血常規(guī)檢測

隨機選取各組小鼠6只，使用l%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為40 mg/kg；采用眼球摘除法分別收集50 μL血液置EDTA抗凝采血管中進行血常規(guī)檢測。

1.7 胸腺系數和脾臟系數檢測方法

隨機選取各組小鼠8只與流式細胞一起取材，暨收集外周血后處死小鼠立即稱體質量、胸腺和脾臟質量，計算如下指標。胸腺系數=小鼠胸腺質量 (mg)/小鼠體質量 (g)，脾臟系數=小鼠脾臟質量 (mg)/小鼠體質量 (g) 。

1.8 流式細胞測定外周血T細胞亞群及NK細胞

隨機選取各組小鼠8只，使用l%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，劑量為40 mg/kg；采用眼球摘除法分別收集外周血50 μl置含EDTA抗凝采血管中，輕柔顛倒搖勻；每個流式檢測管分別加入100 μl全血標本，加入相應的流式抗體，避光孵育30 min，每管分別加入1 ml紅細胞裂解液顛倒混勻，室溫避光孵育5 min，1200 r/min低速離心5 min棄去上清；2 ml PBS緩沖液洗滌細胞1次，1200 r/min低速離心5 min，500 μl PBS緩沖液重懸細胞進行流式細胞測定。

1.9 巨噬細胞吞噬能力測定

隨機選取各組小鼠4只，無菌注射器吸取3%硫代乙醇酸鈉3 ml，注射于小鼠腹腔內；4 d后分別給各組小鼠腹腔注射1 ml 1%羊紅細胞懸液；1 h后頸椎脫臼法將小鼠處死，解剖暴露腹腔，于腹腔靠上部位用鑷子輕輕夾起腹膜，將腹膜剪一小口，用尖吸管注入5 ml預溫的PBS，同時反復揉搓腹腔約1～2 min，以便盡可能多地沖洗出小鼠腹腔的吞噬細胞。用尖吸管吸取腹腔液，置一潔凈試管內吹打均勻；干凈的載玻片上滴加一滴生理鹽水，向其中滴加一滴腹腔液，37 ℃恒溫恒濕箱中孵育60 min；孵育完成后取出玻片，吸去液體；用1∶1丙酮、甲醇溶液固定5 min后，4%吉姆薩染液染3 min，清水沖洗晾干后顯微鏡觀察、拍照。

1.10 統(tǒng)計學方法

2 結果

2.1 小鼠的一般情況

空白組大鼠未見異常, 體質量逐日增加, 攝食量、飲水量增加，毛色有光澤。造模后第4天，造模小鼠均出現毛色發(fā)暗、脫毛、喜臥等現象，各給藥組在服藥后1周后一般情況均較模型組有所好轉。

2.2 各組小鼠血常規(guī)、脾臟和胸腺指數比較

表1示，與空白組比較，模型組淋巴細胞、單核細胞、脾臟指數、胸腺指數均降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；太芪培元顆粒各劑量組、黃芪顆粒組白細胞、中性粒細胞均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；太芪培元顆粒中劑量組與高劑量組淋巴細胞、單核細胞均高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，說明各治療組及黃芪顆粒組均有升高白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞的作用，與黃芪顆粒組比較，太芪培元顆粒高劑量組升高中性粒細胞、單核細胞更明顯。

表1 血常規(guī)、脾臟和胸腺指數比較

2.3 外周血T細胞亞群及NK細胞計數比較

表2圖1示，外周血T細胞亞群結果顯示：與空白組比較，模型組NK細胞計數降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。太芪培元顆粒高劑量組CD8+T淋巴細胞計數較模型組低，CD4+/CD8+比值顯著高于模型組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表2圖2、3示，NK細胞計數結果顯示，各治療組NK細胞比例顯著高于模型組(P<0.05)，說明各治療組均有提高NK細胞的作用，與黃芪顆粒組比較，太芪培元顆粒高劑量組NK細胞升高更加明顯，而且能夠降低CD8+T淋巴細胞計數、升高CD4+/CD8+比值。

表2 各組間流式結果比較分析

圖1 外周血CD4+/CD8+ T細胞比例

圖2 NK細胞計數比例

圖3 (CD3-CD49+)NK細胞流式檢測圖

2.4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能測定

圖4示，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力檢測結果示，各組之間巨噬細胞吞噬能力比較差異無統(tǒng)計學意義。

圖4 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能比較

3 討論

HIV病毒本身并不會引發(fā)任何疾病，而是將人體免疫系統(tǒng)中最重要的T細胞作為攻擊目標，對其大量破壞，最終使免疫系統(tǒng)崩潰，使人體因喪失對各種疾病的抵抗力而發(fā)病。本研究采用環(huán)磷酰胺腹腔注射，也是造成小鼠免疫系統(tǒng)的破壞，并且在試驗過程中維持給藥，造成免疫系統(tǒng)持續(xù)損害狀態(tài)，是目前公認、合理、方便易行的免疫抑制小鼠造模方式。

T細胞表面CD4分子是HIV感染的天然受體，也是HIV攻擊的最主要靶細胞。HIV感染不僅造成外周血CD4+T細胞數量減少,并且導致其功能障礙,是HIV/AIDS的主要改變之一[7]。CD8+為抑制性T淋巴細胞 (Ts),其含量越高免疫抑制越強, 機體的抵抗力越弱[15]。CD8+T細胞不僅在自然老化過程中累積增加，在無臨床癥狀的HIV成年人體內顯著增加。近年來的研究發(fā)現，除了T細胞，巨噬細胞也經歷了功能性極化。巨噬細胞對病毒的細胞毒性作用耐受能力很強[8-10]，因其在HIV-1感染中可以長久地存活并釋放病毒，成為重要的儲存庫部位。NK細胞是一類固有免疫細胞[11]，研究表明，NK細胞具有免疫清除作用，即細胞毒作用、誘導凋亡作用和抗體依賴細胞介導的細胞毒作用；同時具有免疫調節(jié)作用，NK細胞可通過識別和殺傷能夠逃避細胞毒性T細胞殺傷作用的腫瘤細胞或病毒感染細胞,主要通過釋放干擾素、穿孔素、顆粒酶、補充細胞毒性T細胞等產生直接的細胞殺傷作用[12]。HIV感染后NK細胞與疾病進展相關，HAART可部分恢復NK細胞，治療前NK細胞水平與HAART免疫應答相關[13]。最近對猴免疫缺陷病毒感染的獼猴和 HIV 感染者的研究發(fā)現，存在B細胞濾泡中的NK細胞可抑制病毒復制、清除儲存庫，為病毒儲存庫的清除提供新的研究方向。隨著對 NK 細胞研究的深入，其在HIV感染中發(fā)揮的作用也越來越受到重視。

太芪培元方即平艾合劑1號方，主要用于治療艾滋病證屬氣陰兩虛、肺腎不足者，臨床表現為低熱或五心煩熱或夜間潮熱、盜汗或自汗、乏力氣短等。方中以太子參、生地為君藥。太子參味甘微苦，歸脾、肺經，補氣生津；生地味甘、苦、性寒，歸心、肝、肺經，具有養(yǎng)陰生津、清熱涼血作用，兩藥重用共奏益氣養(yǎng)陰之功。該方為新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院院內制劑，臨床觀察發(fā)現，該藥物可以明顯改善患者的臨床癥狀，提高部分患者的CD4+T細胞水平和生存質量[1-5]。但是體外試驗顯示，該藥物體外抗HIV-1病毒的作用不明顯[14]。黃芪含多種有益成分，研究證實黃芪多糖類和黃芪皂苷類物質具有調節(jié)免疫功能的作用，改善生存質量具有較好作用[15]，因此將黃芪顆粒選為陽性對照組。

本試驗研究結果顯示，太芪培元顆粒能夠提高NK細胞數量及CD4+/CD8+比值，降低CD8+數量，提升白細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、單核細胞數量，且太芪培元顆粒高劑量組改善免疫及提升血常規(guī)含量明顯優(yōu)于其他各組。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬能力測定雖然無統(tǒng)計學意義，但從圖片可以看出，太芪培元顆粒高劑量組對巨噬細胞吞噬雞紅細胞的現象要高于空白組。基于此，該藥物對提高免疫功能的改變，可能為通過抑制CD8+T細胞計數及增加NK細胞數量而實現，但是相關影響機制仍需要進一步的試驗研究進行論證。