丙泊酚激活線粒體凋亡通路誘導乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞凋亡和生長阻滯*

張子曦 王永順 向洪聰 肖志波 夏學鑫 蔡志強

(1.湖北江漢油田總醫院麻醉科，湖北 潛江 433124；2.潛江市中心醫院麻醉科，湖北 潛江 433100；3.武漢科技大學附屬醫學院麻醉科，湖北 武漢 430064)

甲狀腺癌是最普遍的內分泌惡性腫瘤，其發病率在全世界范圍內每年以3%的速度不斷增長[1]。乳頭狀甲狀腺癌是最常見的甲狀腺癌類型，占整個甲狀腺癌病例約90%[2]。當前甲狀腺癌的治療選擇通常是手術切除或放射碘治療，在大多數情況下，乳頭狀甲狀腺癌在手術切除后預后良好，少數患者會復發或者發生遠處轉移[3]。因此，迫切需要開發旨在阻斷乳頭狀甲狀腺癌進展的新治療策略。丙泊酚作為常用的靜脈麻醉藥，近年研究發現，丙泊酚(propofol,PPF)還可能具有抗腫瘤作用，如在腎癌、胃癌和膠質瘤等腫瘤治療過程中還表現出較好的抑瘤作用[4-6]。目前仍尚不清楚丙泊酚對乳頭狀甲狀腺癌的影響機制。因此，本研究擬在離體條件下探究丙泊酚通過線粒體凋亡通路對乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細胞凋亡和生長的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗藥物和主要試劑 丙泊酚(100806-201803)購自中國食品藥品檢定研究院，化學式：C12H18O，分子量：178.27，純度≥99.9%，Dulbecco's modified Eagle's medium培養基(12100-046)、胎牛血清(10082-147)、胰蛋白酶(25200-056)、青-鏈霉素(15140-122)購自美國Gibco公司，BRDU細胞增殖檢測試劑盒(C0071S)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(P0012S)、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(C1062S)、線粒體膜電位檢測試劑盒JC-1(C2006)購自上海碧云天生物技術研究所，總超氧化物歧化酶測定試劑盒(A001-3-2)、丙二醛測定試劑盒(A003-1)、谷胱甘肽過氧化物酶(A005-1-2)購自南京建成生物工程研究所，Anti Ki67(ab15580)、PCNA(ab18197)、Bcl-2(ab196495)、Bax(ab53154)、Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、Caspase-9(ab52298)、cleaved Caspase-9(ab2324)、c-Myc(ab39688)購自美國Abcam公司。

1.2 細胞培養 人乳頭瘤狀甲狀腺癌細胞TPC-1來源于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫，細胞培養于10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的高糖DMEM培養基中，并放置在37 ℃，5% CO2恒溫培養箱中。培養基每2～3天更換一次，當需要收集細胞時，用0.25%胰蛋白酶消化。試驗用細胞為對數生長期細胞。

1.3 細胞處理和分組 采用0、12.5、25、50 μM劑量[7]丙泊酚處理TPC-1細胞，將細胞隨機分為PPF 0 μM組、PPF 12.5 μM組、PPF 25 μM組和PPF 50 μM組4組。

1.4 BrdU染色 將細胞傳代接種于6孔板內，待細胞融合率達80%時，用含0.4 %FBS的培養液同步化孵育72 h。加入終濃度為0.03 μg/mL的BrdU繼續孵育40 min。PBS洗滌細胞3次，用多聚甲醛固定10 min，嚴格按照說明書進行細胞增殖檢測。鏡下觀察并計數BrdU陽性細胞數。

1.5 克隆形成法 在培養皿中培養細胞至大約30%匯合度，繼續培養4 d，吹散為單個細胞，用6孔板培養，約500個細胞每孔，培養14天，棄掉培養基，用乙醇固定30 min，接著用0.5%結晶紫染色，用去離子水漂洗晾干，進行拍照觀察。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集懸浮細胞至10 mL的離心管中，每樣本細胞數為3×106/mL，500～1000 r/min離心5 min，棄去培養液，用孵育緩沖液洗滌1次，500～1000 r/min離心5 min，用100 μL的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10～15 min，500～1000 r/min離心5 min沉淀細胞孵育緩沖液洗1次，加入熒光(SA-FLOUS)溶液4 ℃下孵育20 min，避光并不時振動，流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI。

1.7 線粒體膜電位 將各組細胞接種于6孔板后PBS清洗三次，孵育24 h，加入JC-1(5 μg/mL)室溫避光反應30 min。用流式分選儀檢測，記錄紅色和綠色熒光強度。

1.8 Western blot檢測蛋白表達水平 將各組待測細胞用PBS清洗三次，再加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液進行總蛋白提取，BCA試劑盒測定蛋白質含量；提取等量的蛋白質樣品(20 mg)，100 ℃變性5 min。然后進行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉移至PVDF膜，5%的BSA室溫封閉1～2 h后加入相應的一抗，4 ℃過夜孵育，次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，清洗。最后加入發光液后，于凝膠成像儀進行曝光拍照，并用ImageJ軟件統計灰度值計算相對表達量。GAPDH作為上樣量參照，至少重復三個獨立的實驗。

1.9 SOD、MDA、GSH含量測定 按照試劑盒說明書，采用酶標儀測定總超氧化物歧化酶(SOD)含量，采用可見分光光度計測定丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH)含量。SOD在450 nm處測OD值，MDA在532 nm處測OD值，GSH在412 nm處測OD值。

2 結果

2.1 丙泊酚抑制TPC-1細胞增殖 BrdU染色檢測各組細胞增殖情況結果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組BrdU陽性細胞數顯著降低(P<0.05)，見圖1。

圖1 丙泊酚對TPC-1細胞增殖的影響

2.2 丙泊酚抑制TPC-1細胞生長 克隆形成實驗檢測各組細胞生長情況結果顯示，與PPF 0 μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組克隆形成率顯著降低(P<0.05)，見圖2。

圖2 丙泊酚對TPC-1細胞生長的影響

2.3 丙泊酚下調TPC-1細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平 Western blot檢測各組細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平結果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組Ki67、PCNA蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖3。

圖3 丙泊酚對TPC-1細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平的影響

2.4 丙泊酚促進TPC-1細胞凋亡 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況結果顯示，與PPF 0μM組相比較，PPF 25、50μM組細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，見圖4。

圖4 丙泊酚對TPC-1細胞凋亡的影響

2.5 丙泊酚降低TPC-1細胞線粒體膜電位 JC-10檢測各組細胞線粒體膜電位結果顯示，PPF 25和PPF 50 μM組細胞線粒體膜電位較PPF 0 μM組明顯降低，見圖5。

圖5 丙泊酚對TPC-1細胞線粒體膜電位的影響

2.6 丙泊酚升高TPC-1細胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值，下調c-Myc蛋白表達水平 Western blot檢測各組細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達水平結果顯示，與PPF 0 μM組相比較，PPF 25 μM和PPF 50 μM組Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值顯著升高(P<0.05)，c-Myc蛋白水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

圖6 丙泊酚對TPC-1細胞Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、c-Myc蛋白表達水平的影響

2.7 丙泊酚升高TPC-1細胞MDA、GSH含量，降低SOD含量 試劑盒檢測各組細胞SOD、MDA、GSH含量結果顯示。與PPF 0 μM組相比較，PPF 12.5 μM組SOD含量顯著降低(P<0.05)，MDA、GSH含量顯著升高(P<0.05)。PPF 50 μM組SOD含量顯著高于PPF 12.5 μM組(P<0.05)，PPF 12.5 μM組MDA、GSH含量顯著高于PPF 50μM組(P<0.05)，見表1。

表1 丙泊酚對TPC-1細胞SOD、MDA、GSH含量的影響

3 討論

丙泊酚是臨床上常用的靜脈麻醉藥, 在各種手術的麻醉誘導中廣泛使用, 其特有的結構能抑制炎癥細胞聚集、增殖、活化及減少釋放炎癥因子, 從而達到抗炎作用。丙泊酚可通過直接或間接作用抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲、遷移和生存能力, 并促進細胞凋亡, 從而達到有效的抗腫瘤作用[8]。手術治療是乳頭狀甲狀腺癌的首選方法，臨床上多選用丙泊酚對乳頭狀甲狀腺癌進行麻醉[9]。

當細胞增殖失控時會引起腫瘤的發生，因此調控腫瘤細胞的增殖是治療腫瘤的必要手段[10]。Ki67是一種與細胞增殖相關的核蛋白，參與多種惡性腫瘤細胞的增殖與侵襲,其蛋白表達在甲狀腺癌中明顯增高[11]。增殖細胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA) 是一種與細胞增殖狀態有關的核蛋白，其隨著臨床分期增加和淋巴節轉移, 表達水平逐漸增高，表明癌細胞增生活躍，與甲狀腺癌的臨床病理學特點和生物學行為有關，提示預后不良[12]。趙華宇等[13]研究發現丙泊酚通過降低Ki67表達抑制膠質瘤U251細胞增殖。王鵬等[14]研究發現丙泊酚通過下調PCNA表達抑制大鼠肺動脈平滑肌細胞的增殖。本文研究發現，丙泊酚具有下調TPC-1細胞Ki67、PCNA蛋白表達水平，提示丙泊酚通過抑制Ki67、PCNA表達抑制TPC-1細胞增殖。

凋亡是細胞程序性死亡，治療癌癥的化學預防策略之一就是誘導凋亡細胞死亡[15]；其分為外源性凋亡途徑、內源性凋亡途徑(線粒體凋亡途徑)和內質網應激途徑[16]。Caspase家族是細胞凋亡過程中的關鍵元件, 可以通過與眾多蛋白因子的相互作用調控細胞凋亡，其中Caspase-9、Caspase-3在凋亡級聯中過度活化能夠促進細胞凋亡[17]。抗細胞凋亡成員Bcl2，可防止細胞凋亡，而促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質，并在應激下寡聚化，促進線粒體釋放因子，從而引發細胞凋亡[18]。c-Myc是一種常見的原癌基因,可促進細胞增殖或誘導細胞凋亡，在甲狀腺乳頭狀癌中高表達[19]。本文研究發現，丙泊酚具有降低升高TPC-1細胞Bax/Bcl-2、cleaved caspase-3/ Caspase-3、cleaved caspase-9/Caspase-9比值，下調c-Myc蛋白表達水平的作用，提示丙泊酚通過線粒體凋亡途徑誘導TPC-1細胞凋亡。

線粒體是一種存在于大多數細胞中有兩層膜包被的細胞器，是細胞中制造能量的結構。線粒體通透性孔的轉換對細胞的凋亡有著至關重要的作用, 一旦線粒體通透性孔打開, 小分子和離子就會流進線粒體, 導致線粒體膜電位的改變[20]。線粒體膜內外的電勢差降低，引起細胞凋亡的級聯反應，將導致細胞凋亡。本文研究發現，丙泊酚具有降低TPC-1細胞線粒體膜電位的作用，提示丙泊酚通過降低線粒體膜電位調控TPC-1細胞凋亡。

氧化應激是一種復雜的動態過程，其特點是保持活性氧生成與抗氧化劑的活性及有效性之間的平衡。線粒體作為真核生物進行能量代謝的主要場所，在自由基產生、細胞凋亡、衰老等生理病理活動中起到重要作用，是氧化應激作用的重要靶細胞器。SOD和GSH是人體內重要的酶抗氧化系統的主要成員，MDA則是機體內重要的脂質過氧化代謝產物。郝琨等[21]研究發現丙泊酚通過升高SOD含量，降低MDA含量緩解氧化應激有利于結直腸癌根治術患者恢復。本文研究發現，丙泊酚具有升高TPC-1細胞MDA、GSH含量，降低SOD含量的作用，提示丙泊酚通過改善氧化應激調節TPC-1細胞增殖和凋亡。本研究只在細胞水平檢測丙泊酚的作用, 后期將做體內實驗, 以更深入研究丙泊酚在乳頭狀甲狀腺癌中的作用。

4 結論

丙泊酚具有抑制乳頭狀甲狀腺癌TPC-1增殖，促進細胞凋亡，降低線粒體膜電位，改善氧化應激的作用，這可能是通過激活線粒體凋亡通路所實現。