一株厭氧反硝化細(xì)菌的分離鑒定與砷耐受功能研究

馮紀(jì)龍，陳曉明，劉紫薇，羅 鋒

(1.中國(guó)地質(zhì)大學(xué)(武漢)環(huán)境學(xué)院，湖北 武漢 430078；2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056)

砷(As)是一種類金屬元素，有很強(qiáng)的毒性，廣泛存在于地殼與生物圈。它的氧化物——三氧化二砷(AsO)，就是俗稱的“砒霜”。我國(guó)作為糧食生產(chǎn)大國(guó)，土壤中的砷卻嚴(yán)重超標(biāo)，而稻米吸收土壤中的砷，導(dǎo)致砷進(jìn)入人體造成一系列的健康問(wèn)題。我國(guó)砷超標(biāo)大米占全國(guó)總量的1%左右，全國(guó)有60%地區(qū)以食用稻米為主。據(jù)報(bào)道，稻米對(duì)砷的吸收能力比其他農(nóng)作物及蔬菜高很多，在砷污染比較輕的地區(qū)，水稻中的砷從莖葉到稻米的轉(zhuǎn)移系數(shù)比小麥和其他作物高10倍左右。在高砷的環(huán)境下，一部分微生物為了維持正常的生命活動(dòng)，進(jìn)化出耐砷機(jī)能，一些微生物能夠通過(guò)自身生化作用將毒性很強(qiáng)的砷排出體外而進(jìn)入環(huán)境中。微生物對(duì)砷的耐受機(jī)制主要與砷的吸收、氧化還原、甲基化和外排等作用相關(guān)。砷的抗性主要由 arsC 操縱子操控。原核生物的砷抗性研究顯示，砷的抗性主要由3個(gè)基因來(lái)調(diào)控。微生物對(duì)三價(jià)砷[As(Ⅲ)或As]的氧化由砷氧化酶基因(aioA/aioB)調(diào)控，對(duì)五價(jià)砷[As(Ⅴ)或As]的還原由細(xì)菌的砷還原酶基因(arr/arsC)調(diào)控。

第三步：2NO+2H+2e→NO+HO

第四步：NO+2H+2e→N+HO

稻米和蔬菜是人體攝入的主要食物來(lái)源，由于人的活動(dòng)造成了稻米和蔬菜中砷與硝酸鹽超標(biāo)。當(dāng)人體長(zhǎng)期攝入砷與硝酸鹽時(shí)，會(huì)造成機(jī)體的嚴(yán)重?fù)p害。砷污染稻米與硝酸鹽超標(biāo)蔬菜會(huì)經(jīng)過(guò)人體的消化道被胃腸道吸收并釋放部分砷與硝酸鹽產(chǎn)物，人體腸道對(duì)砷與硝酸鹽具有一定的解毒作用，腸道微生物發(fā)揮著重要的作用。砷在人體腸道內(nèi)各個(gè)階段的價(jià)態(tài)和比例各不相同，人體腸道微生物群落結(jié)構(gòu)在各個(gè)時(shí)期也不相同。人體腸道微生物群落對(duì)硝酸鹽的還原途徑主要有兩種：一種是通過(guò)硝酸鹽異化作用還原為銨；另一種是通過(guò)反硝化作用轉(zhuǎn)化為N。

目前關(guān)于硝酸鹽在人體腸道中的還原機(jī)制研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是對(duì)于具有特點(diǎn)的硝酸鹽還原單株菌報(bào)道還很少見(jiàn)。因此，本試驗(yàn)通過(guò)富集與分離方法得到單株

Escherichia

CD14-2，研究了此單株菌的反硝化速率，并對(duì)其耐砷作用進(jìn)行了探究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

用糞便采樣器(Longsee菌群采樣器)和滅菌藥勺采取人體新鮮糞便樣品。志愿者是來(lái)自于非砷污染地區(qū)且6個(gè)月沒(méi)有抗生素治療史的一名健康女性。糞樣為晨便中段約3～4 cm處。

1.1.2 培養(yǎng)基

腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)(g/L):腦心浸液17.5 g，D-葡萄糖2.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉5.0 g，磷酸二氫鈉2.5 g，瓊脂(選擇添加)15.0 g，去離子水1 000 mL。

LB培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g,氯化鈉10 g，去離子水950 mL，瓊脂(選擇添加)15.0 g。

DM培養(yǎng)基(g/L)：硝酸鉀0.72 g，磷酸二氫鉀1 g，七水硫酸鎂1 g，琥珀酸鈉2.8 g，去離子水1 000 mL。

改良后礦物鹽培養(yǎng)基(3M培養(yǎng)基)(g/L)：十二水磷酸氫二鈉7.56 g，磷酸二氫鉀3 g，七水硫酸鎂0.3 g，氯化鉀0.5 g，氯化鈣0.01 g，微量元素溶液，維生素溶液，去離子水1 000 mL。

上述培養(yǎng)基均在121℃、1×10Pa條件下，滅菌30 min備用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 腸道微生物中反硝化細(xì)菌的富集

1.2.2 耐砷反硝化細(xì)菌的分離與純化

1.2.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

觀察菌株的形態(tài)、大小和顏色，進(jìn)行革蘭氏染色，并結(jié)合《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》進(jìn)行形態(tài)特征鑒定。

1.2.4 菌株的16S rRNA和narG功能基因的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

采用煮沸法提取菌株的DNA作為模板，使用16S rRNA基因PCR通用引物進(jìn)行擴(kuò)增。正向引物為27F，反向引物為1541R。其堿基序列分別是5-AGAGTTTGATCCTGGTCAG-3和5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3。反應(yīng)體系為(50 uL)：ddHO 38.75 μL， 10×PCR 緩沖液5 μL，dNTPs 1 μL，27F和1541R各1 μL，Taq polymerase 0.25 μL，DNA模板3 μL。16S rRNA反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，50℃復(fù)性30 s，72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸7 min。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，并將PCR產(chǎn)物送至武漢天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序。

用菌株DNA作為模板，對(duì)菌株的功能基因——硝酸鹽還原酶基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR引物選用墨西哥科學(xué)家Rocio等設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物：

napAf1:5-CTGGACIATGGGYTTIAACCA -3

napAr1:5-CCTTCYTTYTCIACCCACAT-3

narGf1:5-ICAYGGIGTIAACTGYAC-3

narGr1:5-TCGSMRTACCAGTCRTARAA-3

兩對(duì)引物napA和narG期望的PCR片段長(zhǎng)度在500 bp左右，引物由武漢天一輝遠(yuǎn)公司合成，得到目的條帶后進(jìn)行膠回收[DNA膠回收試劑盒QIAquick? Gel Extraction Kit(50)]，然后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化試驗(yàn)，并挑取含有重組質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落進(jìn)行菌液PCR鑒定。菌液PCR引物為通用引物RV-M和M13-47。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，并將電泳條帶在500 bp左右的菌液送至武漢天一輝遠(yuǎn)公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.5 測(cè)定菌株對(duì)不同碳源的利用情況和不同砷濃度下的反硝化能力

1.2.6 測(cè)定方法與數(shù)據(jù)分析

采用紫外分光光度法(BHJ/T 346—200)測(cè)定樣品中硝態(tài)氮(NO-N)含量；采用N-(1- 萘基)- 乙二胺二鹽酸鹽分光光度法(GB 7493—87)測(cè)定樣品中亞硝態(tài)氮(NO-N)含量；采用納氏試劑分光光度法(GB HJ535—2009)測(cè)定樣品中銨態(tài)氮(NH-N)含量；使用pH儀測(cè)定樣品的pH值；采用原子熒光光譜法(AFS)測(cè)定樣品中砷含量。

圖和表使用Origin 9.5和Excel繪制；使用Photoshop CC2015 編輯圖片；系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)使用 MEGA 7.0完成制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 反硝化細(xì)菌的富集、分離與純化

利用BHI培養(yǎng)基進(jìn)行富集，DM培養(yǎng)基和LB固體培養(yǎng)基進(jìn)行分離與純化，用3M培養(yǎng)基測(cè)試分離純化出來(lái)的細(xì)菌功能，得到一株反硝化細(xì)菌CD14-2。該菌株能將10 mM NO-N轉(zhuǎn)化為大約9 mM NO-N，轉(zhuǎn)化率可達(dá)到90%，期間不產(chǎn)生銨態(tài)氮。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)建立與同源性分析

菌株CD14-2在LB固體培養(yǎng)基上的形狀為圓形，顏色為乳白色，微微隆起，單菌落直徑大概在2～3 μm，表面光滑有光澤且有一定的黏性，見(jiàn)圖1。該菌株革蘭氏染色為陽(yáng)性，光學(xué)顯微鏡下觀察為細(xì)小短桿型。將得到的單菌落用LB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)24 h后吸取1 mL菌液，利用煮沸法提取菌株CD14-2 的DNA，然后將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，得到條帶在1 500 bp 左右。通過(guò)測(cè)序得到菌株CD14-2的16S rRNA基因序列，并在NCBI上Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST序列比對(duì)與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株屬于變形菌門，腸桿菌科，埃希氏桿菌屬(CD14-2基因序列與埃希氏桿菌(

Escherichia

fegusonii

)序列相似度達(dá)到了98.43%)，將其命名為

Escherichia

sp.CD14-2。使用鄰接法構(gòu)建菌株

Escherichia

sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。將菌株

Escherichia

sp.CD14-2的16S rRNA基因序列提交Genbank，獲取Genbank登錄號(hào)為MT883284。

圖1 菌株Escherichia sp.CD14-2 平板

圖2 菌株Escherichia sp.CD14-2的16S rRNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)菌株

Escherichia

sp.CD14-2具有反硝化作用，能夠?qū)⑾跛猁}轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。于是對(duì)其反硝化過(guò)程的第一步關(guān)鍵酶——硝酸鹽還原酶基因narG和napA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序(napA擴(kuò)增未成功)。根據(jù)菌株

Escherichia

CD14-2的narG基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行BLAST序列對(duì)比與分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其同源性最近的是

Escherichia

coil

(大腸桿菌)，相似度達(dá)到了98.18%。使用鄰接法構(gòu)建菌株

Escherichia

sp.CD14-2功基于narG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。

圖3 菌株Escherichia sp.CD14-2基于narG同源性的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 菌株Escherichia sp.CD14-2 的反硝化功能

在新鮮糞便中分離出的腸道微生物單株

Escherichia

sp.CD14-2 是一株反硝化細(xì)菌，但是其只能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽并大量累積。本試驗(yàn)探究了菌株

Escherichia

sp.CD14-2在乳酸鈉作為碳源下的反硝化能力，其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 菌株Escherichia sp.CD14-2在乳酸鈉作為碳源下的反硝化速率

在含有乳酸鈉作為碳源的培養(yǎng)基中，菌株

Escherichia

sp.CD14-2 能夠在2 d內(nèi)將10 mM硝酸鹽氮還原為 9 mM亞硝酸鹽氮，還原率達(dá)到 90%左右；而在其他有機(jī)碳源下，該菌株還原硝酸鹽的能力較弱，當(dāng)加入無(wú)機(jī)碳源碳酸氫鈉時(shí)，菌株

Escherichia

sp.CD14-2的反硝化能力很弱，在一周內(nèi)才生成1 mM左右的亞硝酸鹽。

2.4 菌株Escherichia sp.CD14-2對(duì)不同碳源的利用情況

將菌株

Escherichia

sp.CD14-2接種到添加有不同碳源的培養(yǎng)基中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在含有甲酸鈉或甲醇的培養(yǎng)基中細(xì)菌幾乎不具有反硝化功能，在含有碳酸氫鈉或檸檬酸鈉的培養(yǎng)基中該菌株反硝化功能較弱，而在含有乳酸鈉或丙酮酸鈉或葡萄糖的培養(yǎng)基中，該菌株生長(zhǎng)非常迅速且反硝化功能很強(qiáng)。菌株

Escherichia

sp.CD14-2對(duì)不同碳源的利用情況，見(jiàn)表1。

表1 菌株Escherichia sp.CD14-2對(duì)不同碳源的利用情況

菌株分離自新鮮糞樣，屬于腸道微生物。腸道微生物能夠利用多種碳源為機(jī)體和菌株本身提供生長(zhǎng)所需要的能量，菌株

Escherichia

sp.CD14-2的分離純化說(shuō)明腸道微生物具有硝酸鹽還原的能力。如果外部的硝酸鹽濃度過(guò)高對(duì)機(jī)體可能產(chǎn)生嚴(yán)重的危害。

2.5 菌株Escherichia sp.CD14-2的耐砷功能

對(duì)于反硝化細(xì)菌

Escherichia

sp.CD14-2的耐砷功能的探究，可在不同三價(jià)砷濃度下檢測(cè)菌株

Escherichia

sp.CD14-2的OD值來(lái)測(cè)定該菌株的生長(zhǎng)曲線，見(jiàn)圖5。

圖5 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同三價(jià)砷濃度下的生長(zhǎng)曲線

由圖5可見(jiàn)，在LB培養(yǎng)基中，該菌株在無(wú)砷條件下OD值達(dá)到0.8左右，在添加1 mM As(Ⅲ)的情況下其OD值略小于不加入外源砷，而繼續(xù)增加外源砷濃度時(shí)，該菌株的生長(zhǎng)受到抑制。

2.6 不同砷濃度下菌株Escherichia sp.CD14-2的反硝化能力

在測(cè)定不同砷濃度下菌株

Escherichia

sp.CD14-2的反硝化能力時(shí)，選用改良的礦物鹽培養(yǎng)基(3M)作為培養(yǎng)基，乳酸鈉作為有機(jī)碳源,其試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6。

圖6 菌株Escherichia sp.CD14-2在不同砷濃度下硝酸鹽氮的還原和亞硝酸鹽氮的生成曲線

3 結(jié) 論

(1) 本試驗(yàn)采用健康女性的糞便，通過(guò)分離與純化得到反硝化細(xì)菌CD14-2，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析鑒定其為革蘭氏陰性菌，16S rRNA基因序列分析得出其與

Escherichia

fegusonii

相似性達(dá)到98.43%，確定該菌株為埃希氏桿菌屬，并命名為

Escherichia

sp.CD14-2。該菌株的硝酸鹽還原功能與narG基因相關(guān)。(2) 本試驗(yàn)檢測(cè)了菌株

Escherichia

sp.CD14-2對(duì)不同碳源的利用情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能夠快速利用葡萄糖、乳酸鈉、丙酮酸鈉等碳源，對(duì)于甲酸鈉和甲醇幾乎不能利用或者利用緩慢。(3) 砷對(duì)菌株

Escherichia

sp.CD14-2的生長(zhǎng)具有抑制作用，且砷濃度越大其抑制效果越強(qiáng)烈。此外，在不加砷和外源砷濃度在1 mM的情況下菌株

Escherichia

sp.CD14-2能夠在48 h內(nèi)將10 mM的NO-N還原成8.0 mM NO-N并且大量累積；在加入5.0 mM的外源砷時(shí)，菌株

Escherichia

sp.CD14-2能夠在48 h內(nèi)將10 mM的NO-N還原成6.0 mM NO-N，高砷對(duì)其生長(zhǎng)具有抑制作用。(4) 本試驗(yàn)對(duì)富集分離出的菌株

Escherichia

sp.CD14-2 的反硝化能力及其耐砷功能的研究，說(shuō)明人體腸道內(nèi)具有砷抗性微生物，當(dāng)人體攝入少量砷時(shí)，腸道微生物可能具有一定的解毒功能。