基于代謝組學的電針對類風濕關節炎寒證模型家兔尿液內源性代謝物的影響

陳平，杜小正，王海東，田杰祥，李向軍，袁博

基于代謝組學的電針對類風濕關節炎寒證模型家兔尿液內源性代謝物的影響

陳平1，杜小正2，王海東1，田杰祥3，李向軍1，袁博3

1.甘肅省中醫院，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅中醫藥大學附屬醫院，甘肅 蘭州 730000

通過分析類風濕關節炎寒證模型家兔尿液內源性代謝物，基于代謝組學探討電針治療類風濕關節炎的作用機制。將24只家兔隨機分為正常組、模型組和電針組，每組8只，卵蛋白誘導聯合低溫冷凍制備類風濕關節炎寒證家兔模型。電針“足三里”，留針30 min，1次/d，共7 d。干預結束后收集新鮮尿液，氣相色譜-四級桿飛行時間質譜采集家兔尿液代謝物圖譜，結合多元統計方法分析數據；記錄家兔膝關節周徑，測定各組痛閾值，觀察膝關節滑膜組織病理形態。與正常組比較，模型組家兔膝關節周徑明顯增大，痛閾值明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，電針組家兔膝關節周徑明顯減小，痛閾值明顯升高（＜0.05）。模型組較正常組丙酮酸、乳酸、檸檬酸、花生四烯酸、牛磺酸、馬尿酸、色氨酸及尿酸水平相對升高，甘氨酸、苯丙氨酸水平相對降低；電針組較模型組甘氨酸、苯丙氨酸水平上調，其余代謝物水平均下調。模型組較正常組滑膜組織滑膜襯里層細胞明顯增生，層數增多，滑膜組織呈絨毛狀，滑膜內可見微血管擴張、充血、水腫及炎性細胞浸潤；電針組滑膜細胞增生層數較少，炎性細胞浸潤程度及滑膜纖維組織增生程度較模型組明顯減輕。電針可緩解膝關節腫脹，提高痛閾，改善滑膜組織病理形態，調節類風濕關節炎家兔機體能量代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝及嘌呤代謝。

電針；類風濕關節炎；代謝組學；氣相色譜-四級桿飛行時間質譜；兔

代謝組學作為系統生物學的重要組成部分，其研究生物體內相對分子質量較小的代謝物，對組織、細胞及體液中所有代謝產物進行定性和定量分析，為疾病診治提供依據[1-2]。類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以滑膜炎癥和關節、軟骨損壞為主要特征的多系統自身免疫疾病，其發病是多種因素共同作用的結果，這些因素導致RA相關代謝物水平發生變化[3]。通過代謝組學揭示RA發病過程中整體代謝物的改變，發現和篩選基于代謝物的特征性生物標志物，將有助于揭示RA發生發展及相關治療的代謝機制[4]。基于此，本研究利用氣相色譜-四級桿飛行時間質譜技術對RA寒證模型家兔尿液及電針干預后尿液代謝物差異進行探究，應用多變量統計方法對代謝產物進行模式識別，篩選重要的差異代謝物，并結合代謝通路分析，揭示RA疾病及電針干預后RA尿液整體性代謝的變化。

1 材料與方法

1.1 動物

2～3月齡健康普通級雄性新西蘭家兔24只，體質量（2.5±0.5）kg，蘭州生物制品研究所提供。飼養于溫度（20±2）℃、相對濕度（50±10）%環境，每日光照時間12 h，自由攝食飲水。適應性飼養7 d，每周稱重1次。

1.2 主要試劑與儀器

弗氏完全佐劑，美國Sigma公司，批號F5881；卵蛋白干粉，美國Sigma公司，批號A5253-250G。華佗牌SDZ-Ⅱ電針儀（蘇州醫療用品廠有限公司），毛細管色譜柱（英國Agilent公司，HP-5ms），Agilent 7890A/5975C GC/MS系統（美國Agilent公司），顯微鏡（日本奧林巴斯，型號BX53）。

1.3 分組及造模

將24只家兔隨機分為正常組、模型組和電針組，每組8只。采用卵蛋白誘導聯合低溫冷凍法制備RA寒證家兔模型[5-6]。

1.4 干預

電針組先將家兔用改良后兔臺固定，選取“足三里”[7]。針刺8～12 mm，得氣（針下沉緊）后接電針儀。電針參數：疏密波，強度1～2 mA，頻率2 Hz/ 100 Hz，以能見到肌肉震顫、不出現嘶叫為度。每次30 min，每日1次，連續7 d。正常組和模型組不予針刺干預，只做與電針組相同的抓取、固定。

1.5 指標檢測

1.5.1 樣品采集

干預結束后，收集新鮮尿液，8000 r/min離心10 min，EP管收集上層尿液，-80 ℃冰箱保存，備檢。

1.5.2 樣品衍生化處理

尿液解凍，離心取上清液，加尿素酶后混合均勻，37 ℃反應15 min；加甲醇200 μL，置于溫和氮氣下吹干；加30 μL甲氧胺鹽酸吡啶溶液（20 mg/mL），強烈震蕩30 s，37 ℃肟化反應90 min；取出后加入BSTFA衍生試劑30 μL，70 ℃反應60 min，室溫放置30 min，備檢。

1.5.3 氣相色譜-質譜條件

進樣口溫度280 ℃，EI離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，高純氦氣（純度＞99.999%）作為載氣，不分流進樣，進樣量1.0 μL。升溫程序：初始溫度80 ℃，維持2 min，10 ℃/min升至320 ℃，維持6 min。采用全掃描模式進行質譜檢測，檢測范圍為50～550 m/z。采用隨機順序進行連續樣本分析，避免因儀器信號波動造成的影響。

1.5.4 膝關節周徑測定

家兔膝關節股骨內外髁用記號筆標記固定兩點，在固定點測量并記錄膝關節周徑。

1.5.5 痛閾檢測

針刺結束后，用PL-200熱刺痛儀照射兔耳部測痛點，以家兔出現掙扎縮耳作為疼痛反應信號，照射開始至家兔出現反應時間（s）作為痛閾值。連測3次，每次間隔5 min，取平均值。

1.5.6 膝關節滑膜組織病理觀察

采集尿液后，空氣栓塞法處死家兔，剝離滑膜組織，常規HE染色，顯微鏡觀察滑膜組織形態。

1.6 統計學方法

2 結果

2.1 電針對模型家兔膝關節周徑與痛閾的影響

與正常組比較，模型組家兔膝關節周徑明顯增大，痛閾值明顯降低（＜0.05）；與模型組比較，電針組家兔膝關節周徑明顯減小，痛閾值明顯升高（＜0.05）。見表1。

表1 各組家兔膝關節周徑與痛閾值比較（±s）

注：與正常組比較，#＜0.05；與模型組比較，*＜0.05

2.2 電針對模型家兔膝關節滑膜組織病理形態的影響

模型組較正常組滑膜襯里層細胞增生，滑膜組織呈絨毛狀，滑膜內可見微血管擴張、充血、水腫及炎性細胞浸潤；電針組較模型組滑膜細胞增生、炎性細胞浸潤及滑膜纖維組織增生均明顯減輕。見圖1。

2.3 模式識別

將編輯后數據導入SIMCA-P軟件進行無監督PCA，數據矩陣空間分布各組有分開趨勢，各組代謝模式有差異，見圖2。采取有監督PLS-DA對數據進一步分析，顯示各組所有樣本可明顯區分，見圖3。

圖1 各組家兔滑膜組織形態（HE染色，×100）

圖2 各組家兔尿液PCA得分圖

圖3 各組家兔尿液PLS-DA圖

采用PLS-DA模型VIP值（VIP＞1），并結合檢驗的值（＜0.05）尋找差異性表達代謝物。搜索在線數據庫（https://metlin.scripps.edu/index.php）比較質譜精確分子質量，最終根據VIP值（VIP＞1）、分子量，并結合值，得出10種標志物（丙酮酸、乳酸、檸檬酸、花生四烯酸、甘氨酸、牛磺酸、苯丙氨酸、馬尿酸、色氨酸、尿酸）。與正常組比較，模型組丙酮酸、乳酸、檸檬酸、花生四烯酸、牛磺酸、馬尿酸、色氨酸及尿酸水平相對升高，甘氨酸、苯丙氨酸相對水平降低。電針組甘氨酸、苯丙氨酸水平較模型組上調，其余代謝物均下調。見表2。

表2 各組主要差異性代謝物相關系數比較

名稱模型組/正常組電針組/模型組 丙酮酸上升下降 乳酸上升下降 檸檬酸上升下降 花生四烯酸上升下降 甘氨酸下降上升 牛磺酸上升下降 苯丙氨酸下降上升 馬尿酸上升下降 色氨酸上升下降 尿酸上升下降

3 討論

RA目前尚無特效療法。研究顯示，電針在改善癥狀、抗炎鎮痛和免疫調節等方面均表現出較好療效，可多水平、多環節和多途徑控制RA的炎癥反應[8-9]，但對RA相關代謝組學的作用機制尚缺乏探討。

腧穴是影響針刺療效的關鍵因素。足三里屬補益穴之一，針刺該穴可扶正祛邪、舒經通絡，對痹證有良好的止痛效應，且足三里部位肌肉相對豐厚，有利于電針操作。現代研究顯示，電針佐劑性關節炎大鼠“足三里”可減輕足腫脹、關節癥狀評分及足組織炎癥，降低踝關節骨組織Toll樣受體4、髓樣分化因子88和核因子-κB mRNA和蛋白的表達，顯著降低關節炎評分、足和滑膜組織病理損傷，抑制模型大鼠滑膜血管生成，減少CD34陽性表達[10-11]。電針RA大鼠“足三里”可減輕炎癥反應，改善其病理狀態，降低膝關節滑膜組織p-JAK2和p-STAT3的表達，降低JAK2和STAT3 mRNA的表達[12]。

本實驗結果顯示，模型組家兔膝關節周徑明顯大于正常組，電針組家兔膝關節周徑小于模型組。模型組家兔痛閾值低于正常組，電針組痛閾值高于模型組。模型組家兔膝關節可見明顯病理改變，電針組較模型組明顯減輕。模型組乳酸、檸檬酸、丙酮酸水平相對升高。乳酸水平升高提示機體無氧酵解異常加強；檸檬酸作為三羧酸循環的中間代謝產物之一，與機體對能量的需求密切相關，檸檬酸排泄增加，機體能量代謝加快[13]，其含量相對升高，提示RA體內糖有氧代謝部分加快。模型組花生四烯酸水平相對升高，花生四烯酸是機體的一種必需脂肪酸，是多種生物活性物質的前體，可通過環氧化酶途徑和脂氧化酶途徑分別代謝為前列腺素、血栓素和白三烯，在炎癥和免疫反應中起重要調節作用[14]，其水平升高，提示RA存在炎癥反應與免疫紊亂。模型組甘氨酸水平明顯下降，甘氨酸是機體必需氨基酸，甘氨酸受體是一種良好的器官、組織和細胞保護劑，其作為一種重要的抑制性受體，分布在中性粒細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞等細胞膜上，并參與體內免疫反應和炎癥反應。甘氨酸與受體結合，可抑制中性粒細胞、單核巨噬細胞、T淋巴細胞活力及脂肪組織核因子-κB和促炎因子的表達，從而發揮抗炎作用[15]。模型組牛磺酸水平明顯升高，牛磺酸作為一種抗氧化劑，可上調細胞中抗氧化防御系統，間接清除活性氧；還能降低機體細胞內Ca2+濃度，降低抗氧化應激反應程度，減少炎癥因子釋放，抑制氧化應激誘導的炎癥反應以及RA的氧化應激[16]，其水平升高，提示RA氧化應激明顯異常。模型組苯丙氨酸水平下調，馬尿酸、色氨酸水平升高，苯丙氨酸是必需氨基酸，在腸道菌的作用下代謝成馬尿酸，馬尿酸進一步代謝成2-甲基馬尿酸并通過尿液排出，色氨酸作為人體必需氨基酸，可抑制T細胞的增殖。模型組尿酸水平升高，尿酸是降解代謝嘌呤的終產物，能抑制自由基誘導的DNA損傷、清除自由基，可增加氧化應激標志物。

綜上，電針可緩解膝關節腫脹，提高痛閾，改善病理形態，調節RA家兔機體能量代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝及嘌呤代謝。

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Effect of Electroacupuncture on Endogenous Metabolites in Urine of Rabbits with Cold Syndrome of Rheumatoid Arthritis Based on Metabonomics

CHEN Ping1, DU Xiaozheng2, WANG Haidong1, TIAN Jiexiang3, LI Xiangjun1, YUAN Bo3

To explore the metabolomics mechanism of electroacupuncture treatment for rheumatoid arthritis by analyzing the endogenous metabolites in urine of rabbits of rheumatoid arthritis with cold syndrome.A total of 24 rabbits were randomly divided into normal group, model group and electroacupuncture group, 8 rabbits in each group. Rheumatoid arthritis with cold syndrome rabbit model was made with egg protein induction and low temperature freezing method. Electroacupuncture group was applied to “” acupoint once a day for 30 minutes for 7 days. The fresh urine was collected and the urine metabolite profiles were collected by gas chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry, and the data were statistically analyzed by multivariate statistical analysis method after the intervention; the knee joint circumference of rabbits was recorded; the pain threshold of each group was measured; the pathological changes of knee joint synovial tissue were observed.Compared with the normal group, the rabbit knee joint circumference in the model group significantly increased, and the pain threshold was significantly reduced (<0.05). Compared with the model group, the circumference of the knee joint of the rabbits in the electroacupuncture group was significantly reduced, and the pain threshold significantly increased (<0.05). Compared with the normal group, the levels of pyruvate, lactic acid, citric acid, arachidonic acid, taurine, hippuric acid, tryptophan and uric acid in the model group were relatively higher, while the levels of glycine and phenylalanine were relatively lower. Compared with the model group, the levels of glycine and phenylalanine increased, while the other metabolite levels decreased in the electroacupuncture group. Compared with the normal group, the synovial lining cells in the synovial tissue of the model group were significantly proliferated, the number of layers increased, the synovial tissue was villi-like, and microvascular expansion, hyperemia, edema and inflammatory cell infiltration were seen in the synovium; the electroacupuncture group had fewer synovial cell proliferation layers, and the degree of inflammatory cell infiltration and synovial fibrous tissue proliferation were significantly reduced compared with the model group.Electroacupuncture can relieve knee joint swelling, increase pain threshold, improve pathological changes of synovial tissue, regulate energy metabolism, fatty acid metabolism, amino acid metabolism and purine metabolism in rabbits of rheumatoid arthritis.

electroacupuncture; rheumatoid arthritis; metabonomics; gas chromatography-quadrupole time of flight mass spectrometry; rabbits

R245

A

1005-5304(2021)06-0070-05

10.19879/j.cnki.1005-5304.202009333

國家自然科學基金（81960832）；甘肅省高等學校科研項目（2016B-061）；蘭州市科學技術局（2016-RC-50）

杜小正，E-mail：lz-duxiaozheng@163.com

2020-09-21）

2020-11-03；編輯：華強）