基于網絡藥理學探討白藜蘆醇治療肺癌的生物分子機制

張麗慧，耿其順，朱子家，王文斌，沈志博，李礪鋒，薛文華，趙杰

基于網絡藥理學探討白藜蘆醇治療肺癌的生物分子機制

張麗慧，耿其順，朱子家，王文斌，沈志博，李礪鋒，薛文華，趙杰

鄭州大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450052

基于網絡藥理學，運用在線數據庫研究白藜蘆醇治療肺癌的潛在作用機制。通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP）、PubChem、SwissTargetPrediction、GeneCards數據庫分別獲取白藜蘆醇和肺癌的相關基因，取二者交集基因，使用String數據庫獲得交集基因的蛋白相互作用（PPI）網絡圖，使用DAVID6.8對交集基因進行GO和KEGG富集分析。采用Cytoscape3.7.2軟件構建化合物-靶點-通路-疾病網絡模型。使用AutoDock4.2.6軟件對白藜蘆醇和重要靶點進行分子對接。Western blot檢測白藜蘆醇對人肺癌H1975細胞p-Akt蛋白表達的影響。獲得白藜蘆醇和肺癌交集基因78個，PPI網絡圖表明交集基因關系密切。富集分析得到生物過程55項、分子功能26項、細胞組分18項，以及86條相關通路，其中以PI3K-Akt通路富集靶點較多。分子對接結果顯示，白藜蘆醇與PIK3CB、PIK3CA這2個重要靶點均能穩定結合。Western blot檢測結果顯示，白藜蘆醇能夠顯著降低人肺癌H1975細胞p-Akt蛋白表達。白藜蘆醇可能主要通過作用于PIK3CB、PIK3CA靶點，介導PI3K-Akt信號通路發揮治療肺癌作用。

白藜蘆醇；肺癌；網絡藥理學；作用機制；分子對接

研究表明，腫瘤的發生發展與基因突變及多條信號通路改變有關[1-2]。近年來，肺癌的發病率和病死率明顯增高[3]。有資料表明，肺癌的發生與長期吸煙有密切關系[4]。肺癌也是職業癌中最重要的一種，高危職業暴露與肺癌發生有一定關系，且此類患者更易出現肺外病變，伴發呼吸系統疾病，治療更加困難[5]。目前對肺癌主要有化學治療、放射治療及外科手術等手段，但預后并不滿意。肺癌的發病機制復雜，通常涉及多個基因及信號通路，因此，尋找肺癌治療的新靶點、新通路，是提高患者生活質量及改善預后的必要途徑。

白藜蘆醇是一種非黃酮類多酚化合物，存在于多種植物中。研究表明，白藜蘆醇具有抗腫瘤、抗突變、抗菌抗炎、誘導細胞凋亡等生物藥理活性[6]，臨床應用前景廣闊。隨著生物信息學的發展，通過多個生物數據庫分析和整合得到藥物與疾病的關系，成為藥物機制研究的重要方法之一。網絡藥理學將藥物作用網絡與生物網絡結合在一起，利用數據庫分析藥物在網絡中與特定節點或模塊的相互作用關系，從而理解藥物和機體的相互作用[7]。本研究采用網絡藥理學方法探討白藜蘆醇對肺癌的潛在作用機制，為進一步研究白藜蘆醇治療肺癌的藥理機制提供基礎，并為臨床應用提供證據。

1 資料與方法

1.1 藥物與細胞

白藜蘆醇（批號A506244，純度98%），生工生物工程（上海）股份有限公司，使用前用DMSO配制成50 mmol/L母液，-20 ℃保存。H1975細胞株，中國科學院細胞庫提供，用含10%胎牛血清和1%青鏈雙抗的RPMI 1640培養基，于37 ℃、5%CO2、完全飽和濕度條件下常規培養，每48 h更換培養基，細胞生長鋪滿培養皿底80%后，用0.25%胰酶消化，加入新鮮培養基重懸，在37 ℃、5%CO2細胞培養箱中培養過夜，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 白藜蘆醇藥代動力學信息獲取

通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[8]獲取白藜蘆醇的化學結構和藥代動力學相關信息，包括口服生物利用度（OB）、類藥性（DL）、血腦屏障（BBB）、脂水分配系數（ALogP）、氫鍵受體（Hacc）、氫鍵供體（Hdon）、腸上皮通透性（Caco-2）等。

1.3 白藜蘆醇和肺癌相關基因分析

通過PubChem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）[9]獲得白藜蘆醇的canonical SMILES結構，將其輸入SwissTargetPrediction數據庫[10]預測白藜蘆醇的相關基因，并根據可能性（probability）＞0進行篩選。以關鍵詞“Lung cancer”檢索GeneCards數據庫（http://www.genecards.org/），獲取肺癌相關基因，并根據相關性（relevance）≥3進行篩選。使用Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/ index.html）獲取兩者的交集基因。

1.4 交集基因蛋白相互作用網絡構建及中心節點篩選

通過String數據庫（http://string-db.org/）[11]，選用Multiple proteins工具，限定物種為人，得到交集基因的蛋白相互作用（PPI）網絡，保存為TSV格式文件。將文件中的node1、node2、combined score信息導入Cytoscape3.7.2軟件[12]并進行網絡拓撲結構分析，以節點degree值反映基因作用大小，degree≥5的節點為網絡的中心（Hub）節點。

1.5 中心節點GO和KEGG富集分析

使用DAVID6.8數據庫[13]對Hub節點進行GO和KEGG富集分析，以＜0.05為條件，分析前10條生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細胞組分（cellular component，CC）及重要KEGG通路。

1.6 化合物-靶點-通路-疾病網絡構建

將白藜蘆醇、活性靶點及相關通路信息導入Cytoscape3.7.2軟件，構建化合物-靶點-通路-疾病網絡。網絡中節點表示白藜蘆醇、靶點、通路及疾病，連線表示節點間的相互作用。用拓撲參數度數評判網絡中節點的重要性，度數越大表明網絡中與該節點直接相關的節點越多，該節點在網絡中的重要性越高。

1.7 分子對接

將化合物-靶點-通路-疾病網絡中節點度數最高的3個靶點與化合物進行分子對接。分別從ZINC（http://zinc.docking.org/）[14]和UniProt（https://www. uniprot.org/）[15]數據庫獲得白藜蘆醇和靶點蛋白的3D結構，然后運用AutoDock4.2.6軟件[16]，選擇默認設置，設置Grid Box為整個蛋白分子，運行Local Search Parameters進行分子對接，以驗證靶點與化合物的結合活性。

1.8 Western blot檢測

將處于對數生長期的H1975細胞以2×105個/mL接種于6孔培養板中，每孔2 mL，置于37 ℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養。隔夜后，加入不同濃度白藜蘆醇（0、50 μmol/L），于37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養48 h，棄去培養液，用PBS漂洗3次。用RIPA細胞裂解液在冰上進行裂解，提取總蛋白質，使用BCA法測定總蛋白質濃度。取15 μg蛋白質上樣，8%SDS-PAGE凝膠電泳，轉印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應二抗，室溫慢搖孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min。在條帶上滴加100 μL熒光液，使用凝膠成像系統和Image J軟件對各組條帶進行統計分析。每孔設3個復孔。

2 結果

2.1 白藜蘆醇藥代動力學信息

由TCMSP獲得白藜蘆醇藥代動力學相關信息：OB＝19.07%，DL＝0.1，BBB＝-0.1，表明該化合物不易透過血腦屏障；ALogP＝5.28，Hdon＝3，Hacc＝3，Caco-2＝0.80，表明該化合物易通過腸上皮吸收。由此可見，白藜蘆醇滿足一定的成藥條件。

2.2 白藜蘆醇和肺癌相關基因分析

以probability＞0為條件，獲得白藜蘆醇相關基因92個。以relevance≥3為條件，得到肺癌相關基因6596個。兩者共有78個交集基因，占白藜蘆醇相關基因的84.78%，表明白藜蘆醇與肺癌有密切關系。交集基因PPI網絡見圖1。網絡中節點數（number of nodes）為78，邊數（number of edges）為403，平均節點度（average node degree）為10.3，平均局部聚類系數（avg. local clustering coefficient）為0.477，期望邊數（expected number of edges）為143，PPI富集值（PPI enrichment p-value）＜1.0E-16，表明PPI網絡中節點之間關系密切，可信度高，白藜蘆醇與肺癌交集基因之間有高度關聯性。

圖1 白藜蘆醇與肺癌交集基因PPI網絡

2.3 中心節點富集分析

對PPI網絡圖進行拓撲結構分析，degree≥5的節點共55個，即Hub節點。對Hub節點進行GO富集分析，共獲得99個富集結果（＜0.05），包括生物過程55項、分子功能26項、細胞組分18項，居前10位的GO富集結果見圖2。KEGG富集分析得到86條通路（＜0.05），去除廣泛通路后，富集靶點較多的主要信號通路有PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、Ras信號通路（Ras signaling pathway）、FoxO信號通路（FoxO signaling pathway）、Rap1信號通路（Rap1 signaling pathway）等，見圖3、表1。有研究表明，以上通路均與腫瘤的發生與發展密切相關[17-18]。

圖2 白藜蘆醇與肺癌Hub基因GO富集分析

圖3 白藜蘆醇與肺癌Hub基因KEGG通路富集分析

表1 白藜蘆醇與肺癌Hub基因KEGG通路及相關基因

通路基因基因數目 PI3K-Akt signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PDPK1，PIK3CB，GSK3B，RELA，PIK3CA，KIT，CDK4，INSR，CDK2，SYK13 Ras signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PIK3CB，RELA，PIK3CA，PRKACA，KIT，INSR9 FoxO signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PDPK1，PIK3CB，PIK3CA，INSR，CDK28 Rap1 signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PIK3CB，PIK3CA，KIT，INSR，SRC8 HIF-1 signaling pathwayEGFR，PIK3CG，IGF1R，PIK3CB，RELA，PIK3CA，INSR7 ErbB signaling pathwayEGFR，PIK3CG，PIK3CB，GSK3B，PIK3CA，SRC6 TNF signaling pathwayPIK3CG，PTGS2，PIK3CB，RELA，MMP9，PIK3CA6 mTOR signaling pathwayPIK3CG，PDPK1，RPS6KA3，PIK3CB，PIK3CA5 p53 signaling pathwayCDK1，CHEK1，CDK4，CDK24 NF-kappa B signaling pathwayPTGS2，RELA，LCK，SYK4

2.4 化合物-靶點-通路-疾病網絡

白藜蘆醇治療肺癌的化合物-靶點-通路-疾病網絡見圖4。利用Network Aalyzer插件對該網絡進行拓撲分析，獲得節點degree值，根據degree值判斷節點在網絡中的重要性，結果PIK3CB、PIK3CA靶點和PI3K-Akt信號通路的degree值最高，分別為9、9、14，表明其在維持生物網絡的完整性中發揮重要作用。因此，推測白藜蘆醇主要通過作用于PIK3CB、PIK3CA靶點，從而介導PI3K-Akt信號通路，對肺癌產生干預作用。

2.5 分子對接結果

為進一步研究白藜蘆醇與關鍵靶點的相互作用，將獲得的白黎蘆醇3D結構與PIK3CB、PIK3CA對應蛋白的3D結構導入AutoDock4.2.6軟件進行分子對接，結果見圖5。從結合能量最低的對接模型中發現，在GLU714氨基酸位點處PIK3CB與白藜蘆醇之間形成氫鍵，在SER173氨基酸位點處PIK3CA與白藜蘆醇之間形成氫鍵。分子對接結果表明，白藜蘆醇與PIK3CB和PIK3CA兩靶點之間存在緊密聯系，白藜蘆醇可以成為潛在的PIK3CB和PIK3CA作用藥物。

注：藍色代表白黎蘆醇，綠色代表作用靶點，橙色代表信號通路，紅色代表肺癌

圖5 白藜蘆醇與PIK3CB、PIK3CA分子對接示意圖

2.6 Western blot檢測結果

為進一步驗證白藜蘆醇對PI3K-Akt信號通路的作用，使用不同濃度白藜蘆醇處理H1975細胞48 h，Western blot檢測p-Akt蛋白表達，結果見圖6。與0 μmol/L白藜蘆醇比較，50 μmol/L白藜蘆醇作用于細胞后，p-Akt蛋白表達顯著降低。由此可進一步確認，白藜蘆醇能夠對肺癌細胞的PI3K-Akt信號通路產生干預作用，從而治療肺癌。

注：與0 μmol/L白藜蘆醇比較，*P＜0.05

3 討論

白藜蘆醇為低聚物，具有作為抗腫瘤藥物的分子結構基礎，其抗腫瘤活性已有廣泛研究，但作用機制尚不明確[19]。本研究基于網絡藥理學，運用生物信息學數據庫，發現白藜蘆醇與肺癌相關的基因有78個，占白藜蘆醇預測相關基因的84.78%，表明白藜蘆醇對肺癌預防和治療具有一定的作用。交集基因PPI網絡平均局部聚類系數為0.477，＜1.0E-16，表明交集基因之間有密切聯系，且共同作用于肺癌。通過功能富集分析和化合物-靶點-通路-疾病網絡構建，發現白藜蘆醇通過PIK3CB、PIK3CA、PIK3CG、EGFR、IGF1R等靶基因發揮治療肺癌的作用。其中PIK3CB、PIK3CA存在于多條信號通路，在白藜蘆醇-靶點-通路-肺癌網絡中發揮著至關重要的作用。PIK3CA、PIK3CB和PIK3CG分別編碼同源的p110α、p110β和p110γ同工酶，p110γ的表達主要局限于免疫細胞和白細胞，而p110α和p110β的表達普遍存在[20]。對基因工程小鼠的研究表明，這些異構體在PI3K信號的生理和致瘤性上發揮不同作用，其中PIK3CA易發生突變，誘導腫瘤形成[21]。EGFR屬于酪氨酸激酶Ⅰ亞族的跨膜蛋白受體家族，與配體結合活化后可與其他成員形成二聚體結構，通過自身磷酸化啟動一系列級聯反應，參與細胞的信號傳遞，將信號傳至核內，在正常細胞的增殖、分化及遷移等活動中發揮重要作用。有研究表明，EGFR在非小細胞肺癌中高度表達，并且與腫瘤的侵襲遷移能力密切相關[22]。此外，分子對接結果進一步驗證了白藜蘆醇能夠作用于PIK3CB和PIK3CA。因此，我們推斷白藜蘆醇可能通過作用于這些靶基因發揮治療肺癌的作用，這可能是白黎蘆醇治療肺癌的機制之一。

GO功能富集分析顯示，基因主要富集于ATP結合、血紅素結合、鐵離子結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性等分子功能，質膜、細胞內膜結合的細胞器、細胞質核周區域、紡錘體微管等細胞組分，以及RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的調控、細胞增殖和凋亡的調控、肽酪氨酸自磷酸化等生物過程，表明主要生物過程和分子功能均與腫瘤細胞的存活和增殖密切相關。KEGG通路富集分析結果顯示，PI3K-Akt信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路、Rap1信號通路等是白藜蘆醇發揮抗肺癌作用的重要信號通路，其中PI3K-Akt信號通路富集的相關基因最多。研究表明，PI3K-Akt途徑與細胞增殖、細胞凋亡、癌細胞增殖和侵襲能力有緊密聯系，是人類癌癥中最常見的突變網絡之一，其作用是切斷外源性生長刺激對細胞生長、生存和代謝的控制，在癌癥代謝及致癌信號中均發揮著重要作用，該途徑的異常激活與腫瘤發生、癌癥進展和藥物有關抵抗性均密切相關[23]。此外，孫龍和等[24]通過體外細胞實驗表明，白藜蘆醇可通過影響PI3K/Akt信號通路抑制胃癌SGC-7901細胞增殖和遷移。本研究分子生物學實驗結果表明，白藜蘆醇能夠對肺癌細胞的PI3K-Akt信號通路產生干預作用。由此可以推測，PI3K-Akt信號通路是白藜蘆醇治療肺癌的重要信號通路之一。

已有研究表明白藜蘆醇對肺癌有一定治療作用[25]，但其作用靶點及相關信號通路尚不明確。本研究基于網絡藥理學研究方法和分子對接技術分析白藜蘆醇治療肺癌主要相關基因，構建靶標蛋白相互作用網絡，通過對白藜蘆醇治療肺癌的靶點基因進行GO和KEGG通路富集分析，闡述了白藜蘆醇主要通過作用于PIK3CB、PIK3CA靶點，介導PI3K-Akt信號通路發揮抗肺癌的作用機制，可為后續白藜蘆醇治療肺癌的機制研究及臨床應用提供依據。

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Biomolecular Mechanism of Resveratrol Against Lung Cancer Based on Network Pharmacology

ZHANG Lihui, GENG Qishun, ZHU Zijia, WANG Wenbin, SHEN Zhibo, LI Lifeng, XUE Wenhua, ZHAO Jie

Touse the online databases to study the potential mechanism of resveratrol in treating lung cancer based on network pharmacology.The genes related to resveratrol and lung cancer were obtained from TCMSP, PubChem, SwissTargetPrediction and GeneCards database, and the related intersection genes of resveratrol and lung cancer were screened out. The String database was used to draw the PPI network diagram of the intersection genes, and the DAVID 6.8 was used to perform GO and KEGG enrichment analysis. The compound-target-signal pathway-disease network model was constructed by using Cytoscape 3.7.2 software. AutoDock 4.2.6 software was used to perform molecular docking of resveratrol and important targets. Western blot was used to detect the effect of resveratrol on the expression of p-Akt protein in human lung cancer H1975 cell line.Totally 78 intersection genes of resveratrol and lung cancer were obtained, and the PPI network diagram showed that there was a close relationship between them. The enrichment analysis mainly obtained 55 biological processes, 26 molecular functions, 18 cellular components, and 86 related pathways, among which the PI3K-Akt pathway enriched the most targets. Molecular docking results showed that resveratrol could stably bind to two important targets, PIK3CB and PIK3CA. Western blot test results showed that resveratrol could significantly reduce the expression of p-Akt protein in human lung cancer H1975 cells.Resveratrol may mainly act on the targets of PIK3CB and PIK3CA, and mediates the PI3K-Akt signaling pathway to exert anti-lung cancer action.

resveratrol; lung cancer; network pharmacology; action mechanism; molecular docking

R273.42；R285

A

1005-5304(2021)06-0046-06

10.19879/j.cnki.1005-5304.202004113

國家重點研發計劃（2017YFC0909900）

趙杰，E-mail：jiezhaoz2016@163.com

（2020-04-03）

（2020-04-23；編輯：陳靜）