無創糞便SDC2甲基化聯合血清CEA在結直腸癌早期診斷中的應用價值

李 錦，孫 珍

[1.深圳市寶安區中心醫院消化內科(深圳大學第五附屬醫院)，廣東 深圳 518100；2.深圳市寶安中醫院(集團)檢驗科，廣東 深圳 518100]

結直腸癌是臨床上常見的消化道惡性腫瘤，好發于結腸和直腸部位，尤其在老年人群發病較多。近數十年，結直腸癌的發病率在全球呈上升趨勢，其可能與人們生活方式的改變和飲食結構的變化有關[1]。結直腸癌早期，患者大多無明顯癥狀，或癥狀略為輕微、不易發現，具有一定的隱匿性；但其中晚期容易發生全身遠處轉移，常見轉移部位有肝臟、肺及其他器官，嚴重甚至危及生命[2-3]。若臨床上結腸癌能做到早發現、早治療，對提高患者的生存率和生活質量具有重要意義[4]。目前，結直腸癌的診斷主要依靠微創結直腸鏡手術及病理活檢[5]，同時還配合有血清癌胚抗原CEA檢測；但由于結腸鏡檢測是侵入性檢查、需繁瑣的腸道準備、有穿孔的風險等，而血清CEA檢測因敏感度和特異性低而存在明顯的局限性，導致結直腸癌篩查難以普及[6]。有研究[2]表明，糞便DNA檢測其具有無創、方便、診斷效能高等優點，檢測糞便樣本中SDC2甲基化水平，有助于準確預測評估結直腸癌患病情況，且標本采集方法簡單，操作方便、無侵入性。本研究采用無創糞便SDC2基因甲基化聯合血清CEA的檢測對結直腸癌診斷分析，旨在明確其在結直腸癌診斷中的應用及評估價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：選取我院2018年1月～2020年1月收治確診的64例結腸癌患者，58例結直腸瘤患者及60例健康對照組作為研究對象。納入標準[3]:①均經過組織病理確診結直腸癌，既往未接受過任何抗腫瘤治療；②術前無遠處轉移病灶；③自愿參與實驗，同意糞便 SDC2 基因甲基化檢測及 CEA 檢測。 排除標準:①腸鏡檢查發現其他腸道疾?。虎诖嬖谌砀腥拘约膊?、精神疾病，以及其他嚴重器質性病變；③近1個月有肉眼血便者。其中結直腸癌組(n=64)患者男43例，女21例；年齡35～80歲，平均(52.21±10.54)歲；結直腸瘤組(n=58)患者男38例，女20例；年齡34～78歲，平均(47.85±11.81)歲；健康對照組(n=60)男40例，女20例；年齡30～78歲，平均(48.62±9.71)歲。三組患者年齡、性別比較均差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經我院醫學倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2方法：①標本采集：抽取受試者空腹外周靜脈血4 ml，以3 000 r/min 離心15 min后取血清，化學發光免疫分析法，根據試劑盒說明書，應用全自動電化學發光分析儀(CDBASE601 型)檢測血清癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA) 含量。當血清CEA>5 μg/L，檢測結果為陽性。②糞便 DNA 提取及亞硫酸鹽轉化：根據試劑盒說明書，利用糞便DNA 提取試劑盒從糞便樣本(180～220 mg)中提取DNA。同時通過PCR 擴增驗證DNA提取質量。然后采用亞硫酸氫鹽轉化試劑盒將對基因DNA 進行修飾，將未發生甲基化的胞嘧啶轉化為尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不變。③實時熒光定量PCR測定SDC2：采用實時熒光定量PCR SDC2甲基化含量，PCR反應體系為25 μl，包括：TaKaRa EpiTaq HS(5 U/μl)0.125 μl，10×EpiTaq PCR Buffer(Mg2+free)2.5 μl，25 mmol/L MgCl22.5 μl，dNTP Mixture 3 μl，正向引物 1 μl，反向引物1 μl，模板 DNA 2 μl。反應條件：95℃，5 min；95℃，30 s；54～62℃，30 s；72℃，30 s；40個循環；72℃，10 min。 EpiTect PCR 對照組DNA作為陽性對照。擴增產物在3%瓊脂糖凝膠中進行電泳分離，然后進行凝膠成像。

1.3觀察指標：比較三組患者單獨檢測SDC2、CEA及聯合檢測的陽性率。同時通過ROC擴增曲線分析單獨檢測及聯合檢測的靈敏度和特異度。

2 結果

2.1三組患者糞便SDC2、CEA及聯合檢測陽性率比較:結直腸癌組、結直腸瘤組和健康對照組患者SDC2檢測的陽性率分別為67.19%、55.19%和11.67%；CEA檢測的陽性率為39.06%、17.24%和8.33%；聯合檢測的陽性率則分別是82.81%、58.62%和13.33%，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 三組患者糞便SDC2、CEA及聯合檢測陽性率比較

2.2糞便SDC2基因、血清CEA、聯合檢測診斷結直腸癌ROC曲線分析：ROC曲線分析發現，SDC2基因檢測診斷結直腸癌AUC為0.629(95%CI：0.474～0.783)，血清CEA水平診斷結直腸癌AUC為0.512(95%CI：0.357～0.632)，聯合檢測診斷結直腸癌AUC 是0.782(95%CI：0.642～0.856)。聯合診斷結直腸癌的AUC值最高，與單獨SDC2、CEA檢測比較差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1。

圖1 糞便SDC2基因、血清CEA、聯合檢測診斷結直腸癌ROC曲線分析

3 結論

結直腸癌是一種嚴重威脅人類身體健康及生命安全的惡性腫瘤，常見于中老年人，其發病率在全球男性腫瘤中居第三位，女性腫瘤中居第二位[4]。近年，隨著人們生活水平的提高和飲食結構的改變，我國直腸癌發病率和死亡率逐漸升高，并且呈年輕化趨勢；每年死于結直腸癌患者人數高達數十萬；而歐美發達國家結直腸癌的死亡率較我國明顯降低，主要歸因于大規模的結直腸癌普查，對癌前病變進行治療干預，實現了結直腸癌的早期檢測和一級預防[6]。結直腸癌的發病進展較為緩慢，早期多見結直腸黏膜病變，進而演變為腺瘤性息肉，最后發展為惡性腫瘤。若能夠早發現一級預防，二級定期篩查和三級治療，可有效促進患者預后。然而，大多數患者早期無明顯癥狀和臨床體征，同時由于缺少早期診斷，有明顯癥狀時就診已處于中晚期，結直腸癌患者甚至已有遠處轉移。因此，早診斷、早發現、早治療提高患者的生存率，促進預后具有重要意義。

有研究發現，結直腸癌患者糞便/血液中腫瘤相關基因的改變是組織癌變的重要原因之一，其中DNA甲基化情況在結直腸癌診斷及預后具有重要指導意義[5]。學者們發現越來越多游離DNA中某些特定基因甲基化可作為結直腸癌早期診斷、預后等方面的生物標志物，如PCDH10、Septin9、RASSF2、sFPR1、SDC2等，在腫瘤的早期篩選及診斷中應用較多。結直腸癌患者術后特定基因TAC1 甲基化水平會逐漸下降，但復發時DNA 甲基化水平顯著上升，可用來輔助評判結直腸癌治療效果[6]。無創糞便SDC2基因甲基化也有報道，但聯合血清CEA在結直腸癌中的診斷效能如何未見報道，本文就SDC2基因甲基化聯合血清CEA檢測分析評估對結直腸癌的診斷價值。本研究結果顯示，結直腸癌組、結直腸瘤組及健康對照組的SDC2基因甲基化陽性檢出率分別為 67.19%、55.17% 及 11.67%，說明結直腸癌組SDC2基因甲基化的陽性檢出率高于結直腸瘤組和對照組，提示結直腸癌患者糞便中SDC2基因甲基化水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)。結直腸癌組、結直腸瘤組及健康對照組患者的SDC2與CEA聯合檢測的陽性率分別為82.81%、58.62%及13.33%，聯合檢測中結直腸癌陽性檢出率顯著增加，差異有統計學意義(P<0.05)，提示提示聯合檢測對結直腸癌的診斷效能優于單獨檢測?，F階段單一基因檢測結直腸癌的靈敏度偏低，容易出現誤診或漏診[7]。目前，已有研究證實，SDC2基因甲基化在結直腸癌診斷中具有較高的靈敏度和特異度[8-9]。本文ROC 曲線分析發現，聯合診斷結直腸癌的AUC值為0.782，顯著高于單獨SDC2甲基化和血清CEA水平檢測，因此在早期篩查中進行聯合檢測對提高結直腸癌診斷的靈敏度、特異性，將獲益更大[10]。

綜上所述，無創糞便SDC2基因甲基化聯合血清CEA可有效提高結直腸癌的檢出率和診斷準確性，且具有無創、方便、診斷效能高等優點，臨床上值得推廣。