外周血HDAC2、IL-17A在重癥哮喘患者中的表達及意義研究

涂容芳，何振華，譚小武，陳 哲，羅 卿，陳 林，陳 偉，謝 莉，楊艷霞

(南華大學附屬第二醫院呼吸與危重癥醫學科，湖南 衡陽 421001)

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是一種全球常見、多發的慢性氣道炎性反應性疾病，絕大部分哮喘患者可經吸入性糖皮質激素治療得到控制，但仍有部分哮喘患者需大劑量吸入甚至口服糖皮質激素才能控制或仍未獲控制，稱之為重癥哮喘(Severe asthma,SA)。最新流行病學調查研究表明全球約有3 億成年哮喘患者[1-2],重癥哮喘發生率高達5%～10%，其產生的醫療負擔已超過哮喘總費用的 50%，給人們造成了極大的痛苦及經濟負擔。因此，探討一種能早期預測SA 的簡便指標，以盡早識別 SA 患者并予以準確干預治療，對改善患者預后具有重要意義。本研究擬通過研究重癥哮喘患者、普通哮喘患者及健康對照人群外周血組蛋白去乙酰化酶2(HDAC2)、白細胞介素-17A(IL-17A)表達水平的差異及重癥哮喘患者中兩者的相關性，探討其對重癥哮喘早期診斷及激素治療是否敏感的預測價值。

1 資料與方法

1.1一般資料：選擇2018年1月～2019年1月在我院治療、隨訪的哮喘患者60例為研究對象，其中重癥哮喘患者30例設為重癥哮喘組，普通哮喘患者30例設為普通哮喘組。重癥哮喘組中男16例，女14例，年齡22～63歲，平均(40.1±8.52)歲；普通哮喘組中男13例，女17例，年齡20～60歲，平均(39.2±7.68)歲。選取同期在本院進行健康體檢的30例健康志愿者作為對照組，其中男18例，女12例，年齡18～60歲，平均(40.3±7.56)歲。三組研究對象的性別構成比、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究已獲南華大學附屬第二醫院醫學倫理委員會批準實施，全部研究對象均知情同意。病例組納入標準：①哮喘診斷明確，診斷標準參照中華醫學會呼吸病學分會哮喘學組《支氣管哮喘防治指南》和 GINA 2015；②年齡 18～65歲，性別不限。對照組納入標準：①年齡18～65歲，性別不限；②無變態反應性疾病，無吸煙史，無哮喘病史、癥狀及體征，近2周內無呼吸道感染史。排除標準：①認知能力低影響自評量表填寫者；②有嚴重心、肝、腎功能障礙，或其他感染性疾病；③有嚴重氣胸不能進行肺功能檢測者。

1.2方法

1.2.1受試者血清HDAC2、IL-17A水平檢測：于清晨空腹時采集肘靜脈全血4 ml置于未加抗凝劑的試管中，標本采集后在室溫下靜置2 h，離心機離心后(3 000 r/min)取上清分裝，并將標本放于-20℃冰箱儲存待測。采用ELLSA法測定血清HDAC2(試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司)及IL-17A(試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司)水平，具體步驟嚴格按照說明書操作。

1.2.2肺功能檢測最大呼氣峰流速(PEF)值、1 s用力呼氣容積(FEV1)及最大呼氣中期流量(MMEF )：患者靜息20 min后抬頭挺胸，手持儀器，口含咬嘴。囑患者深吸氣，然后用爆發力吹氣，吹氣時儀器右側指示燈會快速閃爍，保持穩定吹氣6 s至燈滅則吹氣完成。采用德國Master Screen肺功能測試系統連續檢測3次肺通氣功能，所檢測到的結果中若用力肺活量(FVC)和FEV1的變異度均<5%則判定為合格，最終結果取3次結果中的最佳值記錄。

2 結果

2.1三組受試者血清HDAC2表達對比：重癥哮喘組患者外周血血清中HDAC2的水平低于普通哮喘組及對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，普通哮喘組和對照組外周血血清中HDAC2表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2三組受試者外周血血清中IL-17A表達對比：重癥哮喘患者外周血血清中IL-17A的水平高于普通哮喘組及對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，普通哮喘組和對照組外周血血清中IL-17A表達水平差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 三組受試者外周血中HDAC2、IL-17A表達水平對比

2.3三組受試者PEF、FEV1及MMEF表達對比：重癥哮喘組和普通哮喘組患者PEF、FEV1及MMEF水平均低于對照組，以重癥哮喘組最明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 三組受試者PEF、FEV1及MMEF水平對比

2.4重癥哮喘組患者肺功能、HDAC 2、IL-17A之間相關性分析：重癥哮喘患者肺功能PEF、FEV1及MMEF與其外周血中HDAC2表達呈正相關(r=0.750、0.782、0.708，P<0.05)，與IL-17A表達呈負相關(r= -0.719、-0.748、-0.711，P<0.05)，HDAC2與IL-17A之間呈負相關(r=-0.892，P<0.05)。見表3。

表3 重癥哮喘組患者肺功能與HDAC2、IL-17A之間相關性分析

3 討論

支氣管哮喘特別是重癥哮喘發病機制復雜，既往研究認為哮喘的主要發病機制是TH1/TH2細胞免疫失衡[3]，即抗原經過樹突狀細胞等呈遞后誘導T細胞分化成為TH2細胞，分泌TH2型炎性細胞因子如IL-4、IL-5和IL-13，這些炎性因子導致嗜酸性粒細胞、T淋巴細胞和肥大細胞募集，從而誘導哮喘氣道高反應性和黏液高分泌。然而，最近的臨床研究發現40%以上的哮喘以中性粒細胞炎性反應浸潤為主[4-5]，同時約有10%～15%重度哮喘患者對吸入糖皮質激素治療不敏感，存在激素抵抗(GC 抵抗)[6]，激素抵抗機制成為近年來研究的熱點和難點。近年來已有研究表明：GR SNPs、GR 修飾(磷酸化、亞硝基化、泛素化、巰基化、氧化還原應激等)、GR-α基因表達減少、GR-β表達增加、GCs 細胞外排增加、促炎轉錄如JNK/AP-1、JAK3/STAT5、NF-κB、HDAC2、IL-17A等過度激活及促炎轉錄因子過度表達都可能影響糖皮質激素的生物學效應，引起 SA 對激素抵抗[7-10]。本研究擬通過研究重癥哮喘患者、普通哮喘患者及健康對照人群外周血HDAC2、IL-17A表達水平的差異及重癥哮喘患者中兩者的相關性，探討它們對重癥哮喘早期診斷及激素治療是否敏感的預測價值。

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)最初是由 Taunton 等[11]人1996 年發現的一類蛋白酶，其在修飾染色體結構和調控遺傳基因轉錄表達等方面發揮了重要的作用，HDACs 共有四大類，組蛋白去乙酰化酶 2(HDAC2) 是第 I 類組蛋白去乙酰化酶，含有一個保守的、約 400 個氨基酸殘基的催化結構域，由 1 個底物結合位點、1 個鋅離子結合位點和 2 個金屬離子結合位點構成胞核內的一種對染色體的結構修飾和基因表達調控發揮著重要作用的蛋白酶。Trevor 等[12]報告糖皮質激素可通過募集HDAC2使GR去乙酰化，GC 與核因子κB(NF-κB)結合并激活 AP-1形成 GC-NFκB/AP-1 復合體，抑制促炎因子轉錄，促炎因子合成減少，炎性反應減輕或受抑；此外，HDAC2 可使組蛋白去乙酰化，組蛋白與帶負電荷的促炎性反應因子 DNA結合更緊密，促炎性反應轉錄因子不能與 DNA 特異位點結合，轉錄受到抑制，表達下調，從而發揮抗炎作用。當 HDAC2 表達下調時，可能引起激素抵抗，抗炎作用減弱。Hao M等在6周齡BALB/c小鼠哮喘模型的研究中發現，暴露于吸煙組(SEA)小鼠肺組織活檢標本中 HDAC2 表達較卵清蛋白(OVA)激發哮喘組小鼠低[13]。Ito等在40名受試者的支氣管黏膜活檢組織中也發現 HDAC2 表達水平與重癥哮喘患者的激素療效有關[14]。白細胞介素-17(IL-17)是 Th17 細胞分泌的一種炎性反應介質[15]，Semlali 等發現 IL-17A 可促進GR-β 在外周血單核細胞中表達增多，使 GR-β/GR-α 的比例倒置，最終產生激素抵抗[16]。以中性粒細胞浸潤為主的哮喘，對糖皮質激素治療的反應差，而在募集中性粒細胞的過程中，IL-17 起著至關重要的作用[17-18]。 高水平的 IL-17 與中性粒細胞氣道炎性反應的嚴重程度呈正相關，且這類哮喘患者在糖皮質激素治療后中性粒細胞的數量并不降低，因此IL-17不僅可誘導杯狀細胞增生及黏液分泌造成氣道重塑，還在重癥哮喘激素抵抗中起了重要作用[19]。SA嚴重程度常規采用肺功能評估，其中PEF表示最大呼氣流速率是判斷哮喘嚴重度最簡便可靠的客觀手段，當PEF<0.2 L/min提示氣道存在嚴重阻塞；而FEV1、MMEF是反映氣道阻力最常用的指標，當FEV1<1.0 L時提示病情嚴重，當FEV1<0.5 L時則有發生窒息的可能。但肺功能檢查操作復雜還對患者要求較高，如遇SA急性發作時不僅會因患者病情重配合不佳而無法準確反映病情，還存在病情加重甚至窒息、死亡風險，因此尋求簡單、無創、高特異性檢查指標或方法意義重大。本研究表明：重癥哮喘患者血清HDAC2水平顯著低于普通哮喘患者和對照組人群，差異有統計學意義(P<0.05)，且與其PEF、FEV1及MMEF呈正相關，差異有統計學意義(P<0.05)。重癥哮喘患者血清IL-17A水平顯著高于普通哮喘患者(P<0.05)和對照組人群(P<0.05)，且與其PEF、FEV1及MMEF呈負相關(P<0.05)。而普通哮喘與對照組外周血血清中HDAC2、IL-17A水平差異無統計學意義(P>0.05)，進一步提示外周血 HDAC2、IL-17A水平作為評估哮喘表型的生物標志是可行的，因其簡單、方便和安全，在預測激素治療效果和識別“真”“假”重癥哮喘患者方面有較好的臨床運用前景。

綜上所述，重癥哮喘患者的外周血中存在HDAC2、IL-17A表達增加，并且HDAC2、IL-17A表達水平與患者的肺功能密切相關，但具體機制尚不清楚。最近的一項研究表明，敲除 HDAC2 基因后，能使屋塵螨誘導的氣道炎性反應及黏液分泌進一步加重，并能調控 Th17 細胞分化促進 IL-17A的分泌，而敲除 IL-17 基因或使用 IL-17A 中和抗體后能使由 HDAC2 基因缺失誘導的氣道炎性反應得到緩解[20]，顯示 HDAC2 可以通過抑制氣道上皮細胞產生IL-17A 的表達來減弱氣道炎性反應。另外，有文獻報道IL-17A 可在氣道上皮中誘導糖皮質激素不敏感，其機制可能與 PI3K 信號通路激活導致 HDAC2 活性降低有關[9]。本研究發現重癥哮喘患者中HDAC2、IL-17A表達水平呈負相關，差異有統計學意義(P<0.05)，由此推測HDAC2、IL-17A參與重癥哮喘的機制可能與下調HDAC2、上調IL-17A參與激素抵抗有關。