非小細胞肺癌患者外周血造血干細胞相對計數和絕對計數檢測的臨床意義＊

趙芷潔若，劉云鶴，劉阿慶，夏 穎，張 冠，楊艷杰，于建春

肺癌是全世界發病率和病死率最高的惡性腫瘤之一。2018年全球腫瘤統計分析報告顯示，全球新增肺癌患者209.4萬例，死亡176.1萬例，分別占全部癌癥發病和死亡的11.6%和18.4%［1］。肺癌在我國男性腫瘤發病率中居首位，2018年我國的統計數據顯示，全國77.4萬的新增肺癌病例，約有69萬人死于肺癌［2］。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌病例的85%，其5年生存率僅為15%［3］。造血干細胞（hematopoietic stem cell，HSC）是血液系統中的成體干細胞，是一個異質性的群體，具有長期自我更新的能力和分化成各類成熟血細胞的潛能［4］。在骨髓中，具有自我更新能力的HSC產生多能祖細胞，進而產生各種不同譜系的祖細胞，如粒細胞-巨噬細胞祖細胞，共同（普通）淋巴祖細胞等［5］。研究表明［6］，HSC數量的減少可導致T細胞介導的適應性免疫的長期損傷，與白血病的復發及預后密切相關。因此，造血干細胞移植越來越廣泛地應用于各種血液病、惡性腫瘤等疾病的治療［7，8］。同時，造血干細胞功能的正常與否，決定著與機體免疫細胞數量的多少及功能是否正常［9］。因此，檢測腫瘤患者外周血HSC的相對計數和絕對計數具有重要的意義。CD34是一種單鏈跨膜蛋白，是造血干細胞標志物，未成熟的造血前體細胞以及骨髓和血液中的造血集落細胞（包括單能和多能祖細胞）上都存在CD34抗原［10］。研究發現［11］，CD34還在血管源性腫瘤、胃腸道間質瘤、孤立性纖維性腫瘤等軟組織腫瘤中均有不同程度的表達。但有關CD34+HSC在NSCLC患者外周血中的含量及與患者預后相關性研究較少。筆者對NSCLC患者外周血中CD34的相對計數及絕對計數進行檢測，探討其與NSCLC患者預后的關系?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2018年9月—2019年9月筆者醫院收治的100例非小細胞肺癌患者。其中男77例，女23例；年齡45～80歲，平均（63.58±9.20）歲；其中有吸煙史61例，無吸煙史39例；鱗癌35例，腺癌65例；病理分型低分化37例，中-高分化63例；臨床分期Ⅰ+Ⅱ期50例，Ⅲ+Ⅳ期50例；有淋巴結轉移62例，無淋巴結轉移38例；有遠端轉移51例，無遠端轉移49例。納入標準：均經影像學與病理學檢查確診，臨床分期依據第8版TNM分期［12］；年齡18～80歲；預計生存期≥3個月；Karnofsy狀態量表（KPS）得分≥60分；無合并急性感染或其他部位腫瘤，無傳染病、自身免疫性疾病及血液系統疾病等。排除標準：病理診斷不能確診為非小細胞肺癌或無病理診斷；合并急性感染或其他惡性腫瘤；合并嚴重心腦血管疾病，糖尿病，免疫系統疾病或精神障礙等疾病。該研究經醫院倫理委員會討論研究后通過，所有患者及其家屬知情后簽署知情同意書。

另外選取52例同期在醫院體檢且年齡相匹配的健康人作為正常對照組（normal controls，NCs），所有入組正常人無惡性腫瘤、急性感染、嚴重基礎疾病、自身免疫系統疾病或血液系統疾病，且血常規、肝功能、腎功能、血糖、血脂等實驗室檢查及心電圖、胸片等輔助檢查均正常。

1.2 方法（1）臨床資料收集。收集入組患者的臨床病理特征以及復發轉移或死亡的相關信息，分析HSC相對計數和絕對計數與NSCLC患者的臨床病理特征以及預后的相關性。同時比較HSC絕對計數與CD3、CD4、CD8、B、NK細胞絕對計數的相關性。無進展生存期（Progression free survival，PFS）定義為從入組之日起，到疾病復發、轉移、或任何原因導致患者死亡［13］。隨訪截止時間為2020-09-30。（2）外周血造血干細胞（CD34+HSC）檢測。抽取NSCLC患者及正常人（NCs）外周血各2 ml于EDTA抗凝管中，每份樣本取1支BD Trucount管；采用BDTMStem Cell Enumeration試劑盒（貨號：344563），檢測外周血造血干細胞（CD34+細胞）。主要步驟：往管底加入20μl的BD Stem Cell試劑；往管中加入20μl 7-AAD試劑；往管中加入100μl充分混勻的抗凝全血，輕微渦旋混勻，室溫避光孵育20 min；每管中加入2 ml 1×氯化銨裂解液，輕微渦旋混勻；室溫避光孵育10 min；立即將制備好的樣本置于濕冰上，用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測。（3）外周血淋巴細胞檢測。采用BD Multitest IMK kit（貨號：340503）試劑盒，檢測CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T細胞，CD19+（B細胞），CD3-CD16+CD56+（NK細胞）。主要步驟：每個樣本取有兩支BD Trucount試管，分別標記為A、B，以示區別；取20μl BD Multitest CD3/CD4/CD8/CD45試劑，加入到A管的底部；取20μl BD Multitest CD3/CD16+CD56/CD45/CD19試劑，加入到B管底部；取50μl充分混勻的抗凝全血，加到各管底部，充分渦旋混勻，室溫避光孵育20 min；每管中加入460μl 1×BD MultitestIMK kit溶血素，輕微渦旋混勻，室溫避光孵育15 min；隨后于BD FACSCalibur流式細胞儀上進行檢測。

1.3 統計學方法采用SPSS 25.0軟件進行統計分析，2組計量資料服從正態分布，采用兩獨立樣本t檢驗，用（±s）表示，不服從正態分布，則采用非參數檢驗，用中位數（下四分位數～上四分位數）表示；計數資料比較采用χ2檢驗；HSC相對計數、絕對計數對PFS的影響采用Kaplan-Meier生存分析法，應用Log-rank檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCLC患者與正常人組（NCs）CD34+HSC相對計數和絕對計數比較經非參數檢驗顯示，100例NSCLC患者CD34+HSC相對計數中位數為0.8%（0.40%～1.80%），52例正常人CD34+HSC相對計數中位數為2.36%（1.73%～3.67%），差異具有統計學意義（P＜0.001）。NSCLC患者CD34+HSC絕對計數中位數為0.66（0.31～1.42）cells/μl，正常人組CD34+HSC絕對計數中位數為1.66（0.95～2.36）cells/μl，差異具有統計學意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 NSCLC患者與正常人CD34+HSC相對計數和絕對計數比較（＊＊＊P＜0.001）

2.2 不同臨床分期NSCLC患者CD34+HSC相對計數和絕對計數比較經非參數檢驗顯示，50例Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者CD34+HSC相對計數中位數為2.13%（1.20%～4.76%），50例Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者CD34+HSC相對計數中位數為0.5%（0.20%～1.18%），2組比較差異具有統計學意義（P=0.003）。Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者CD34+HSC絕對計數中位數為1.02（0.433～2.15）cells/μl，Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者CD34+HSC絕對計數中位數為0.535（0.188～1.205）cells/μl，2組比較差異具有統計學意義（P=0.001），見圖2。

圖2 不同臨床分期NSCLC患者HSC相對計數和絕對計數比較（＊＊P＜0.01）

2.3 CD34+HSC絕對計數與NSCLC患者臨床病理特征的關系以100例NSCLC患者的CD34+HSC絕對計數中位數0.66 cells/μl為界值分為CD34+HSC＜0.66 cells/μl組和CD34+HSC≥0.66 cells/μl組，每組各50例。經單因素分析顯示，不同臨床分期、是否存在淋巴結轉移、是否出現遠端轉移以及CD4+T淋巴細胞絕對計數在CD34+HSC＜0.66 cells/μl組和HSC≥0.66 cells/μl組具有顯著差異 （P＜0.05）。而不同年齡、性別、是否吸煙、病理類型、腫瘤大小、分化程度、CD3+T細胞、CD8+T細胞、B細胞和NK絕對計數在CD34+HSC＜0.66 cells/μl組和CD34+HSC≥0.66 cells/μl組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 CD34+HSC絕對計數與NSCLC患者臨床病理特征的關系

2.4 HSC相對計數和絕對計數對NSCLC患者無進展生存期（PFS）的影響Kaplan-Meier預后分析顯示，與CD34+HSC相對計數＜0.80%患者的PFS相比，CD34+HSC相對計數≥0.80%患者的PFS顯著延長，差異具有統計學意義，經Log-rank檢驗（P=0.043）。與CD34+HSC絕對計數＜0.66 cells/μl患者的PFS相比，CD34+HSC≥0.66 cells/μl患者的PFS顯著延長，差異具有統計學意義，經Log-rank檢驗（P=0.026），見圖3。

圖3 NSCLC患者HSC相對計數和絕對計數與PFS相關性分析（＊＊P＜0.01）

3 討論

肺癌的發生率呈逐年上升趨勢，且多數患者在就診時已屬晚期，治愈率極低［14］。以往肺癌的治療方法主要包括手術、放療、化療、小分子靶向治療等，雖然在一定程度上能夠改善患者的預后，但最終晚期腫瘤還是容易復發和轉移，病死率極高［15］。因此，近年來腫瘤免疫治療越來越受到研究者的重視，腫瘤免疫治療也被稱為最有望能攻克腫瘤的治療方法之一［16］。造血是機體血液中的細胞成分不斷得到補充的過程，造血系統由各種高度分化的細胞群組成，其中HSC在造血系統中發揮重要作用。骨髓中的HSC具有自我更新和產生各種祖細胞的能力，包括淋巴樣干細胞和髓樣干細胞，淋巴樣干細胞進一步分化為祖T細胞、祖B細胞和NK前體細胞［17］。研究發現［18］，T細胞減少，增加造血干細胞移植的排斥風險，且易出現惡性血液病復發。因此，造血干細胞對于免疫細胞的數量及其功能具有重要的影響，對于抗腫瘤免疫防御具有重要意義。

在腫瘤免疫治療中，T細胞、B細胞、NK細胞均發揮重要作用。其中，CD3+細胞為總T細胞，根據功能又可將其分為CD4+T和CD8+T細胞。CD4+T細胞亞群參與了適應性免疫系統的發展和維持，在免疫應答中發揮雙重作用。CD4+T細胞亞群可以分化為不同的亞群，具有不同的功能和特性，可刺激Th1和CD4+細胞毒性T細胞的細胞毒性反應，起到免疫監視的作用，同時，在免疫反應的初級和次級階段可以增強和維持細胞毒性CD8+T細胞反應［19］。CD8+T細胞，作為細胞毒性細胞，在主要組織相容性復合體Ⅰ類分子存在的情況下識別抗原，并分泌細胞溶解顆粒和趨化因子來破壞癌細胞。自然殺傷細胞（natural killer cell，NK）在先天免疫反應中發揮核心作用［20］。B細胞是體液免疫的主要參與者，在抗原存在的情況下可激活T細胞，同時活化的B細胞具有細胞毒性作用殺傷腫瘤細胞［21］。

該研究中，NSCLC患者CD34+HSC相對計數（0.8%）和絕對計數（0.66 cells/μl）明顯低于正常人，CD34相對計數（2.36%）和絕對計數（1.66 cells/μl），差異具有統計學意義。Ⅲ+Ⅳ期NSCLC患者CD34+HSC相對計數（0.50%）和絕對計數（0.535 cells/μl）明顯低于Ⅰ+Ⅱ期NSCLC患者CD34相對計數（2.13%）和絕對計數（1.02 cells/μl），差異具有統計學意義。單因素分析顯示，CD34+HSC絕對計數水平與不同臨床分期、是否存在淋巴結轉移、是否出現遠端轉移以及CD4+T淋巴細胞絕對計數相關。研究還發現，CD34+HSC相對計數和絕對計數具有判斷NSCLC患者預后的價值。Kaplan-Meier生存分析顯示，CD34+HSC相對計數≥0.80%、HSC≥0.66 cells/μl患者的PFS顯著延長，且具有顯著性差異，提示CD34+HSC含量高的NSCLC患者預后較好，這與國外一項研究結果一致［6］。

綜上所述，外周血CD34+HSC水平與非小細胞肺癌密切相關，可以作為非小細胞肺癌預后的一個重要的指標。