hCG日孕酮過高或過低對年輕全胚冷凍患者周期累積活產率的影響

詹少泉 鄭海燕 曹明珠 劉見橋 毛玉玲 龍曉林 劉寒艷

1廣州醫科大學附屬第三醫院婦產科，生殖醫學中心，廣東省產科重大疾病重點實驗室，廣東省生殖醫學重點實驗室（廣州510150）；2浙江大學醫學院附屬第一醫院生殖醫學中心（杭州310003）

在常規的體外受精（IVF）周期中，人絨毛膜促性腺激素（hCG）給藥當天的孕酮（P4）升高［1］對新鮮周期的子宮內膜環境有不利影響［2］，導致妊娠率降低［1，3-4］。而hCG 日孕酮水平升高對卵母細胞或胚胎質量的影響，存在爭議。有研究認為，hCG日孕酮升高導致胚胎質量受損［5-6］，降低累積活產率［7-8］，其他研究則認為對胚胎質量［1，4］和累積活產率均無影響［9］。此外，當hCG 日孕酮水平過低（＜0.5 ng/mL）對新鮮周期活產率有影響［10-11］，但是對全凍周期活產率以及累積活產率的影響尚無相關報道。因此，本研究的目的是通過評估hCG 日孕酮水平過高或過低對年輕全胚冷凍患者凍融胚胎移植（FET）后累積活產率的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2018年12月期間行全胚冷凍的周期，根據新鮮周期hCG 日孕酮水平的不同進行回顧性分析。納入標準：取卵年齡≤35 歲，第1 次IVF 周期，拮抗劑方案或者激動劑方案。 排除標準：微刺激或自然周期，IVF+RICSI，IVF+ICSI 周期，PGT 周期，卵子冷凍周期，二次冷凍周期，未獲得活產但仍有凍存胚胎未移植者，失訪或結局指標缺失者。同一組中每名患者只納入一次統計。該研究征得患者知情同意并獲得醫院倫理委員會的批準。基線資料包括患者的取卵年齡、不孕年限、身高、體質量指數、抗苗勒氏激素（AMH）、基礎FSH（bFSH）、基礎LH（bLH）、原發不孕比例以及不孕因素分布。

1.2 分組有研究認為P4 ＞1.14 ng/mL時，新鮮移植會影響活產率［12］，而P4在0.5 ～1.2 ng/mL時，活產率最高［10-11］。參考既往研究［3-4］應用的臨界值劃分，根據hCG日孕酮水平將3 923例患者分為四組：組1（＜0.50 ng/mL，n= 801），組2（0.50 ～1.14 ng/mL，n= 1 626），組3（1.15 ～1.49 ng/mL，n= 499）和組4（≥1.50 ng/mL，n=997）。組2 為對照組。

1.3 方法

1.3.1 卵巢刺激和胚胎冷凍標準采用GnRH 激動劑方案或GnRH 拮抗劑方案［13］，當至少兩個卵泡直徑＞17 mm 時，用4 000 ～10 000 IU 的hCG（麗珠，珠海麗珠）或重組HCG（艾澤，瑞士默克雪蘭諾）誘導最終的卵母細胞成熟。在hCG 日進行孕激素測定，空腹取肘靜脈血5 mL，采用全自動電化學發光免疫分析儀（雅培i4000SR）檢測。hCG 觸發后34 ～36 h 進行卵母細胞采集。

第3 天冷凍胚胎評分標準為：5 ～12 個細胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一或不完全均等大小，＜50%空泡，＜50%多核。第3 天優質胚胎標準為：7 ～9 個細胞，≤20%碎片，卵裂球大小均一，無空泡或多核。根據患者情況以及知情同意，在第3 天冷凍0～4 個胚胎，剩余胚胎行囊胚培養，在囊胚階段，根據Gardner 分類法在第5、6 天評估胚胎質量。囊胚在3～6 級擴張、ICM 和TE 的發育至少達到一個B 級或以上時冷凍。3 ～6 級，ICM 和TE均不含C 級時為優質囊胚。

1.3.2 FET 內膜準備、玻璃化冷凍和復蘇準備冷凍胚胎移植的患者根據月經和排卵情況采用自然周期或人工周期。玻璃化冷凍和復蘇采用商品化試劑盒（日本，加藤），卵裂胚冷凍在室溫下進行，ES 液中5 min，VS 中45 ～60 s。囊胚在玻璃化冷凍之前，先進行激光人工囊胚皺縮，冷凍過程在37 ℃下，ES 液中2 min，VS 中45 ～60 s。然后用最小體積的玻璃化溶液將胚胎裝載到冷凍載體Cryotop 頂端，并立即在-196 ℃下浸入液氮中。卵裂胚和囊胚復蘇過程相同，復蘇時，迅速將Cryotop頂端置于37 ℃的TS 中1 min，然后在室溫下依次將胚胎轉入DS、WS1、WS2 中各3 min。最后將存活的胚胎移入平衡過的培養液中，置于37 ℃、6%CO2的培養箱中培養等待移植。培養2 ～4 h 后在超聲引導下進行宮內移植。

1.4 觀察指標觀察指標包括新鮮周期卵巢刺激情況、胚胎培養情況以及全凍周期首次移植的活產率和累積活產率。活產，是指胚胎移植后在妊娠≥28 周時產下一個存活的嬰兒。累積活產，是指一次促排卵周期后的凍融移植周期獲得至少一次活產。至2020年12月如患者未獲得活產但仍有剩余的未移植的冷凍胚胎，則不納入統計，多次活產僅納入首次活產周期。

1.5 統計學方法采用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差表示，對于正態或非正態分布資料分別采用兩獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney′sU檢驗，計數資料用例（%）表示，采用χ2檢驗或Fisher精確概率計算法。結局指標進行單因素和多因素回歸分析，校正混雜因素，分析影響結局的相關因素。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者新鮮周期的基礎參數情況各組間取卵年齡、不孕年限、身高、體質量指數、AMH、bFSH、bLH、原發不孕比例以及不孕因素分布差異均無統計學意義。見表1。

表1 患者新鮮周期的基礎參數情況Tab.1 Basic parameters in the fresh cycles included ±s

表1 患者新鮮周期的基礎參數情況Tab.1 Basic parameters in the fresh cycles included ±s

指標例數取卵年齡［例（%）］≤25 歲26～30 歲31～35 歲不孕年限（年）身高（cm）體質量指數（kg/m2）抗繆勒氏激素（ng/mL）bFSH（U/L）bLH（U/L）原發不孕［例（%）］不孕因素［例（%）］輸卵管盆腔因素排卵障礙子宮內膜異位癥男性因素雙方因素組1（＜0.5 ng/mL）801 29.31±2.97 90（11.24）425（53.06）286（35.71）3.97±2.31 158.62±4.41 21.40±3.14 7.82±4.62 4.97±1.25 4.86±3.98 471（58.80）393（49.06）82（10.24）16（2.00）123（15.36）187（23.35）組2（0.5 ～1.14 ng/mL）1 626 29.48±3.02 154（9.47）854（52.52）618（38.01）3.99±2.37 158.40±4.56 21.33±3.04 7.54±4.45 5.07±1.28 4.57±2.87 921（56.64）783（48.15）143（8.79）22（1.35）263（16.17）415（25.52）組3（1.15 ～1.49 ng/mL）499 29.74±2.89 42（8.42）245（49.10）212（42.48）3.86±2.38 158.14±4.62 21.47±3.05 7.19±4.40 5.08±1.48 4.48±3.09 274（54.91）228（45.69）49（9.82）11（2.20）83（16.63）128（25.65）組4（≥1.5 ng/mL）997 29.52±2.71 82（8.22）518（51.96）397（39.82）3.93±2.32 158.20±4.95 21.27±3.01 6.93±5.25 5.11±1.35 4.47±3.03 569（57.07）488（48.95）73（7.32）24（2.41）172（17.25）240（24.07）P 值0.087 0.118 0.687 0.158 0.632 0.075 0.174 0.138 0.565 0.409

2.2 患者新鮮周期的卵巢刺激、胚胎發育情況組1 與組2（對照組）相比，Gn 啟動量、hCG 日E2 水平、獲卵數和冷凍胚胎數均顯著下降，優質胚胎率和冷凍胚胎率顯著增加（均P＜0.01）。組3 與組2（對照組）相比，Gn 總量顯著增加（P＜0.05）。組4與組2（對照組）相比，Gn 啟動量、Gn 總天數和Gn總量均顯著增加，優質胚胎率和冷凍胚胎率顯著下降（均P＜0.01）。新鮮周期全胚冷凍原因在各組間差異均有統計學意義（P＜0.001），組1、組2和組3 冷凍主要原因為預防卵巢過度刺激綜合征（OHSS），組4 冷凍主要原因為生化指標異常（如E2 升高，P4 升高等），其次為預防OHSS。見表2。

表2 患者新鮮周期的卵巢刺激、胚胎發育情況Tab.2 Ovarian stimulation and embryo development in the fresh cycles included ±s

表2 患者新鮮周期的卵巢刺激、胚胎發育情況Tab.2 Ovarian stimulation and embryo development in the fresh cycles included ±s

注：Gn 為促性腺激素；HCG 為絨毛膜促性腺激素；E2 為雌二醇；OHSS 為卵巢過度刺激綜合征；ICSI 為卵胞漿內單精子顯微注射；IVF為體外受精；與組2 對比，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001

指標例數促排方案［例（%）］激動劑方案拮抗劑方案Gn 啟動量（IU）Gn 總天數Gn 總量（IU）HCG 日E2（pmol/L）新鮮周期全胚冷凍原因［例（%）］預防OHSS盆腔或宮腔因素血清生化指標異常個人因素其他因素授精方式［例（%）］ICSI IVF獲卵數優質胚胎數優質胚胎率［例（%）］冷凍胚胎數冷凍胚胎率［例（%）］組1（＜0.5 ng/mL）801 610（76.15）191（23.85）147.09±42.06*11.99±2.60 1 865.88±757.48 15 294.70±4 261.56***668（83.40）89（11.11）4（0.50）10（1.25）30（3.75）146（18.23）655（81.77）17.65±7.12***3.73±3.09 2 984（35.41）**8.35±5.09 **6 691（62.26）***組2（0.5 ～1.14 ng/mL）1 626 1 226（75.40）400（24.60）152.15±40.42 11.93±2.37 1 937.35±721.27 16 788.22±2 884.48 1 409（86.65）130（8.00）36（2.21）18（1.11）33（2.03）307（18.88）1 319（81.12）20.06±7.19 3.93±3.30 6 396（33.34）9.16±5.18 14 893（60.61）組3（1.15～1.49 ng/mL）499 379（75.95）120（24.05）157.00±39.69 12.09±2.22 2 051.86±776.92*16 754.91±2 908.95 400（80.16）28（5.61）62（12.42）3（0.60）6（1.20）84（16.83）415（83.17）20.44±7.74 3.91±3.41 1 951（31.73）9.44±5.49 4 709（59.28）組4（≥1.5 ng/mL）997 735（73.72）262（26.28）167.07±45.55***12.49±2.36***2 299.96±925.12***16 487.30±3 167.09 178（17.85）16（1.60）797（79.94）4（0.40）2（0.20）191（19.16）806（80.84）20.70±9.30 3.71±3.42 3 696（31.43）**8.82±5.74 8 798（58.42）***P 值0.627＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.708＜0.001 0.254＜0.001＜0.001＜0.001

2.3 全凍策略后首次FET 周期情況及累積活產率與對照組相比，組1、組3 和組4 中首次FET 的胚胎數、時間、移植優質胚胎周期比例、內膜厚度和自然周期比例以及首次移植活產率差異均無統計學意義（P＞0.05）。組4 累積活產率顯著低于對照組（69.71%vs. 75.83%，P＜0.01），組1、組3 累積活產率與對照組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。組4 各年齡段累積活產率最低，組2 最高，年齡分層后的累積活產率見圖1。全凍策略后首次FET周期情況及累積活產率見表3。

表3 全凍策略后首次FET 周期情況及累積活產率Tab.3 First FET cycle and cumulative live rate after freeze-all strategy例（%）

圖1 年齡分層后的P4 各組累積活產率Fig.1 Cumulative live birth rate in different P4 groups after age stratification

2.4 多因素回歸分析P4對全凍周期累積活產率的影響校正年齡、不孕年限、可利用胚胎數、授精方式后發現，取卵周期hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL仍顯著降低累積活產率（OR= 0.759，95%CI：0.63～0.91，P＜0.01），P4 ＜0.5 ng/mL 不會影響全凍周期累積活產率（P＞0.05）。

3 討論

P4 ≥1.5 ng/mL 是目前廣泛使用的孕酮升高的閾值［3］，目前孕酮升高會通過降低子宮內膜容受性而對植入產生不利影響已達成共識［2，14-15］，因此全胚冷凍可以部分緩解這一問題。另有研究提出，提前升高的孕酮水平不僅對種植窗子宮內膜存在影響，對胚胎的發育也有負面效應［5-6］，認為孕酮增加與優質囊胚率降低有關［16］。本研究中也得到了相似的結果，P4 ≥1.5 ng/mL 組在年齡、獲卵數與對照組相似的情況下，盡管優質胚胎數與冷凍胚胎數無明顯差異，但是優質胚胎率和冷凍胚胎率顯著下降。迄今為止，大多數研究者僅探討新鮮周期hCG 日高孕酮水平對新鮮移植周期的影響［10］，以及在第一次冷凍胚胎移植的妊娠率，而不是累積妊娠率［17］。只有少數研究探討了其對累積活產率的潛在影響［7-9］，且有研究納入了包含新鮮移植周期的累積活產率［7-8］，而目前已經明確高孕酮對新鮮移植周期結局的負面影響，從而影響了累積活產率的準確性。本研究評估了新鮮周期hCG 日各孕酮水平對年輕患者全凍周期累積活產的影響，從而提高了結果的臨床適用性。數據表明，當新鮮周期hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL，解凍周期首次活產率無差異，累積活產率降低，接著對取卵年齡等因素進行了校正后，P4 ≥1.5 ng/mL 對累積活產率仍產生影響，這也間接說明高孕酮對胚胎質量（而不僅僅是形態學質量）產生了影響，從而降低了累積活產率，雖然高孕酮影響胚胎質量的機制尚不清楚。

P4 1.0 ～1.49 ng/mL 組與對照組相比，和≥1.5 ng/mL 組一樣，在獲卵數與對照組相似的情況下，優質胚胎率和冷凍胚胎率差異無統計學意義，在未校正或校正其他因素后，全胚冷凍首次移植累積活產率差異也無統計學意義。說明在這個范圍內的孕酮對胚胎質量并沒有影響，也不會影響累積活產率。

與對照組相比，低孕酮組（P4 ＜0.5 ng/mL）患者取卵年齡差異無統計學意義，獲卵數較少，導致冷凍胚胎數較少，但是優質胚胎率和冷凍胚胎率顯著增加，說明低孕酮并不會影響胚胎質量。之前的研究認為hCG 日低P4 水平與黃體生成減少和/或子宮內膜容受性改變有關［10］，從而導致新鮮移植周期活產率降低［10-11］。本研究發現，新鮮周期的低P4 水平并不會影響全凍周期的首次移植活產率和累積活產率，說明低P4 水平并不會影響胚胎質量。

本研究局限性主要為：（1）為避免其他潛在的混雜因素，本研究研究對象僅包括取卵年齡在≤35 歲、第1 次IVF 周期、拮抗劑方案或者激動劑方案的患者。（2）有研究認為P4 對高反應的患者移植結局影響更明顯［11］，但是本研究并沒有對不同卵巢反應的患者進行分析。（3）由于只納入了年齡≤35 歲的患者，所以本研究結果是否適用于高齡患者還需要進一步研究。

綜上所述，hCG 日孕酮水平≥1.5 ng/mL 顯著降低年輕患者全胚冷凍后的累積活產率，可能與高孕酮水平影響優質胚胎率和冷凍胚胎率有關，孕酮水平＜0.5 ng/mL 不會影響胚胎質量，也不會影響全胚冷凍周期的累積活產率。