全外顯子測序技術鑒定一個常染色體顯性遺傳性痙攣性截癱3A型家系ATL1基因突變

鄭備紅 孫艷 邱淑敏 陳曉菁 杜生榮 楊春梅

1福建省婦幼保健院，福建醫科大學附屬醫院（福州350001）；2福建省生殖醫學中心（福州350001）

遺傳性痙攣性截癱（hereditary spastic paraplegias，HSP）是一組具有高度臨床和遺傳異質性的神經系統變性疾病［1-2］，發病率約為1.8/100 000［3］。根據其臨床表型，HSP 可分為單純型和復雜型，單純型HSP 主要臨床特征為漸行性雙下肢痙攣性肌無力、肌張力增高、腱反射活躍亢進及痙攣步態；復雜型HSP 除了表現出痙攣性截癱的癥狀外，還可伴有其他神經系統的癥狀，如小腦共濟失調、智力遲鈍、癲癇、耳聾、視網膜病變、視神經萎縮、肌肉萎縮、皮膚病和周圍神經病等［4-6］。HSP 遺傳方式有常染色體顯性遺傳（autosomal dominant，AD），常染色體隱性遺傳（autosomal recessive，AR）和X連鎖遺傳（X-linked，XL），也可見母系遺傳（maternal inheritance）（或線粒體相關遺傳）［7-8］，其中以AD-HSP最為常見。截止目前，已報道的HSP亞型有70 多種，并已鑒定出超過80 個基因與HSP 相關聯，根據其基因型被發現的順序命名為SPG1-77［9-13］。

中國人群AD-HSP 主要以痙攣性截癱類型4（SPG4）和痙攣性截癱類型3A（SPG3A）為主［14］。AD-HSP 常見致病基因有SPAST、ATL1、REEP1 和KIF5A 等［13-14］。典型的SPG4 發病年齡都在青少年或成年后發病，并且進展緩慢。而SPG3A 主要表現為單純型HSP，極少數患者表現為復雜型HSP，該病發病年齡主要集中于兒童時期（＜10 歲），ATL1（OMIM182600）基因變異是引起SPG3A 型主要致病原因。本研究應用全外顯子測序技術在一個三代遺傳性痙攣性截癱家系中鑒定了一個ATL1 基因雜合錯義突變c.715C ＞T，Sanger 測序驗證該突變在家系中表現出基因型與表型共分離，明確致病突變可為家系成員提供準確可靠的遺傳咨詢和產前診斷。

1 對象與方法

1.1 研究對象本研究家系來自福州（圖1），連續三代發病，共4 名患者，其中女性患者2 名，男性患者2名，先證者（Ⅳ：13）為35歲女性，自幼雙下肢便開始出現僵硬、活動不便、行走無力，主要癥狀表現為雙下肢肌張力增高、腱反射活躍亢進、病理征陽性，行走呈剪刀步態，且癥狀隨著年齡增長呈進行性加重，能緩慢獨立行走，患者智力正常，精神發育正常，余未見異常，符合典型的單純性痙攣性截癱。家系中先證者的外公（Ⅱ：1）、母親（Ⅲ：8）和舅舅（Ⅲ：3）3 名成員皆有類似癥狀，據先證者自述，其母親和舅舅自學會走路卻出現行走困難的臨床表現，家系中其余成員均無相似臨床癥狀，根據家系圖譜（圖1）可初步推斷該病呈常染色體顯性遺傳模式。本研究中所有參與者均簽署了知情同意書，并得到了福建省婦幼保健院倫理委員會的批準。

圖1 遺傳性痙攣性截癱家家系圖Fig.1 Family diagram of hereditary spastic paraplegia.The arrow indicates the proband

1.2 方法

1.2.1 外周血基因組DNA 提取采集先證者及其家系成員靜脈血2 mL，利用DNA 提取試劑盒（Blood Genomic DNA Mini Kit，德國Qiagen 公司）提取基因組DNA，用Nanodrop 2000（美國Thermo 公司）超微量核酸蛋白測定儀對樣本DNA 進行質控。使用Qubit 核酸定量儀（美國Thermo 公司）對DNA 濃度進行精確定量。

1.2.2 建庫捕獲和高通量測序本研究采用安捷倫v6 捕獲芯片系統（Agilent SureSelect Human All ExonV6 試劑盒）進行建庫和捕獲實驗，嚴格按照最新優化的實驗步驟操作：首先使用Covaris 破碎儀將基因組DNA 隨機打斷成長度為180 ～280 bp的片段，片段兩端經末端修復和加A 尾后分別連接上接頭制備成DNA 文庫。帶有特異index 的文庫pooling 后與生物素標記探針完成液相雜交，再采用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來，PCR 線性擴增后構建文庫，經Agilent 2100 生物分析儀器（美國Agilent 公司）對文庫質量檢測合格后，在Illumina HiSeq 2500 測序儀（美國Illumina 公司）上完成高通量測序。

1.2.3 數據篩選和生物信息學分析目標區域測序原始數據經過質量控制后，應用BWA 軟件與人基因組數據庫（HGl9）進行比對，采用GATK 和VarScan 軟件對單個核苷酸多態位點（SNP）、小片段缺失/插入（InDels）進行分析，重點關注呈常染色體顯性遺傳的基因，應用dbSNP 數據庫、ExAC數據庫、HapMap 數據庫、千人基因組計劃數據庫完成數據過濾篩選，保留突變頻率小于1%的位點，通過SIFT 和Polyphen-2 等在線功能預測工具對可疑突變位點進行致病性預測，檢索HGMD 和Clinvar 等相關基因突變數據庫對可疑致病位點進行確認，同時依據美國醫學遺傳學與基因組學會發布的《序列變異解讀標準和指南》對序列變異位點判讀，基于先證者表型篩選出有害變異。

1.2.4 Sanger 測序驗證采用Sanger 測序方法對全外顯子測序分析篩選出的可疑基因致病突變位點進行家系共分離驗證。利用premier 5 軟件設計引物對gDNA 進行PCR 擴增，正向引物：5′-TGTGAGAAGAGCAGGTTTCAGGAGT-3′，反向引物：5′-TCCTCAAGATAAAAGGGGACAATA-3′。擴增體系及條件，總體系20 μL，包括7.5 μL Q×Buffer，2.0 μL 10×Buffer，1.0 μL MgCl2，四種dNTPs（10 mmol/L）0.4 μL，Hotstar Taq（5 U/L）0.1 μL，上下游引物（100 ng/L）各2 μL，DNA 模板（100 ng/L）1 μL，ddH2O 加至20 μL。反應條件為：95 ℃預變性5 min，95 ℃30 s，62 ℃30 s，72 ℃30 s，32 個循環，最終72 ℃延伸10 min，PCR 產物純化后經ABI 3170 測序儀（美國ABI 公司）完成雙向測序，測序結果與ATL1 基因（轉錄本序列NM_015915.4）進行比對。

2 結果

通過全外顯子測序和生物信息學分析，在數據庫中分析比對后發現先證者（Ⅳ：13）ATL1 基因第10 號外顯子存在c.715C ＞T 雜合突變，引起編碼蛋白的第239 位氨基酸由精氨酸變成半胱氨酸（p. R239C），該變異位點在dbSNP、ExAC、ESP6500和1000 Genomes 等均未見收錄，依據ACMG 判讀該位點為疑似致病，既往已有文獻報道ATL1 基因c.715C ＞T 雜合突變與致遺傳性痙攣性截癱3A型相關。采用Sanger 測序方法對先證者及其家系成員gDNA 進行驗證，測序結果發現家系中患者（Ⅱ：1，Ⅲ：3，Ⅲ：8）均攜帶該雜合突變位點，先癥者突變位點遺傳自母親，而其他正常成員均未攜帶此突變，從而證實基因型和疾病表型完全共分離，表明ATL1 基因c.715C ＞T 為該家系發生遺傳性痙攣性截癱致病原因。

圖2 Sanger 測序驗證結果Fig.2 Sanger sequencing results

3 討論

遺傳性痙攣性截癱是一組與神經系統退行性病變相關的單基因遺傳病，可發病于任何年齡段，但以兒童和青春期多見［3-4］。由于亞型多且表型復雜，臨床上極易誤診漏診，需與遺傳性共濟失調、肌萎縮側索硬化癥及腎上腺脊髓神經病相鑒別診斷。所有遺傳性痙攣性截癱類型中，文獻報道研究最多的是常染色體顯性遺傳痙攣性截癱（AD-HSP），其中以痙攣性截癱類型3A（SPG3A）、痙攣性截癱類型4（SPG4）最為常見，分別占40%和10%［13］。

SPG3A 是由ATL1 基因突變導致的單純性ADHSP，ATL1基因定位于14q22.1，包含14個外顯子，編碼一個由553 個氨基酸組成的Atlastin-1 蛋白［15］。Atlastin-1 蛋白是一種與動力蛋白相關的GTP 酶，主要表達于腦部組織的皮質、海馬和皮層脊髓束神經元，參與管狀內質網的形成和軸突的伸長［16］。NAMEKAWA 等［17］發現ATL1 基因變異可造成GTP酶活性缺失，可通過顯性負效應抑制內質網的形成及內質網運輸囊泡至高爾基體，形態異常的內質網和高爾基體會引起皮質脊髓束等神經元的死亡，從而造成SPG3A 疾病的發生。通常ATL1基因缺陷的患者發病年齡較早，本研究中的患者剛學走路時即表現出行走困難，其臨床表型符合SPG3A 型診斷特征。

迄今為止，國內外已報道了ATL1 基因致病突變類型90 余種，絕大多數為錯義突變，少數為剪接位點、小片段缺失/插入和大片段缺失突變，錯義突變分布較為平均。本研究通過對先證者全外顯子組測序檢測，發現先證者（Ⅳ：13）ATL1 基因第10 號外顯子存在c.715C ＞T 雜合突變，引起編碼蛋白的第239 位氨基酸由精氨酸變成半胱氨酸（p. R239C）。既往已有多篇文獻報道該位點與遺傳性痙攣性截癱3A 型相關［18-20］，ZHAO 等［21］在對142 個遺傳性痙攣性截癱家系ATL1 基因篩查中發現，絕大多數突變發生在ATL1 基因的第4、7、8 和12 號外顯子上，其中有31 個家系均攜帶c.715C ＞T（p. R239C）雜合錯義突變（21.83%），表明第239位氨基酸是一個高頻致病突變位點。

目前尚無有效的針對HSP 的治療方法，現階段常見做法是聯合藥物和物理療法來緩解HSP 的癥狀是，一定程度上改善患者的生活質量［22］。藥物的作用主要是抑制突觸反射力，松弛肌張力及補充神經營養；物理療法包括推拿按摩、電刺激和針灸等。對于嚴重的痙攣畸形可采用手術進行矯正，以改善痙攣步態。

綜上所述，本研究在一個三代遺傳性痙攣性截癱家系中采用全外顯子測序技術鑒定了一個已報道的ATL1 基因c.715C ＞T（p.R239C）雜合錯義突變，明確致病突變可為家系成員提供準確可靠的遺傳咨詢和產前診斷。HSP 在家系中呈常染色體顯性遺傳，患者的子女中將有50%的發生風險，且男女患病的機會相等。因此，建議家系中的患者生育時須行產前診斷或植入前遺傳學診斷，以阻斷遺傳病向子代傳遞。