miR-209下調MEK/ERK信號通路抑制膠質瘤U87細胞增殖、增強放療敏感性的研究

楊彬 于晶 劉曉智 陳鐳

天津市第五中心醫院神經外科（天津300450）

腦膠質瘤是中樞神經系統原發腫瘤之一［1］，惡性膠質瘤具有高度侵襲、增殖能力強的特點，常規手術加術后輔助放療能降低部分腦膠質瘤復發率，提高生存率［2］，但仍有研究報道常規手術加外放療在原發灶周圍局部復發，導致放療失敗［3］，提高膠質瘤的放療敏感性是目前膠質瘤治療研究的重點。miRNA 是一類長度大約20～25 個核苷酸非編碼RNA［4］，通過與靶基因3′-UTR 結合調控多種疾病的發生發展［5］，多項研究證實miR-200家族成員影響腦膠質瘤的發生發展，本研究通過Real-time PCR 法檢測miR-200 家族成員中的miR-209、MEK/ERK 在膠質瘤U87 細胞中的表達，研究miR-209 對膠質瘤U87 細胞的增殖和放療敏感性的影響，初步探討miR-209 以及MEK/ERK 信號在膠質瘤放療抵抗中的機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象膠質瘤U87 細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器熒光實時定量PCR 試劑盒（TaKaRa，日本），鼠抗人MEK/ERK 抗體（Abcam 公司，美國），LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美國），DMEM 細胞培養基，青霉素/鏈霉素雙抗試劑，10%胎牛血清，0.25%胰蛋白酶、CCK-8 試劑盒均購自自南京凱基生物公司，RIPA 蛋白裂解液（江蘇碧云天公司），miR-209、MEK、ERK、miR-209 mimics 引物序列由杭州四季青生物工程有限公司（表1）。

表1 目的基因引物序列Tab.1 Primer sequence of target gene

1.3 實驗方法

1.3.1 Real-time PCR 檢測放療后膠質瘤U87 細胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達細胞培養：DMEM 完全培養基培養膠質瘤U87 細胞，加10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/L，培養條件：5%CO2、溫度37 ℃，濕度為95%。收集對數生長期的膠質瘤U87 細胞，使用6MV X 線照射，照射劑量8 Gy，TRIzol法提取細胞內總RNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，miR-209、MEK、ERK引物序列為模板，反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸40 s，共40個循環，根據公式Folds=2-△△Ct來計算目的基因的相對表達量，其中△△Ct=（Ct檢測基因-Ctβ-actin）實驗組-（Ct檢測基因-Ctβ-actin）對照組。

1.3.2 轉染miR-209 對膠質瘤U87 細胞增殖、放療敏感性的影響收集對數生長期的膠質瘤U87細胞，取miR-209 mimics 100 pmol 與Lipofectamine 10 μL充分混勻，室溫孵育1 h，放入培養箱中與膠質瘤U87 細胞培養24 h，使用6MV X 線照射，照射劑量8 Gy，TRIzol 法提取細胞內總RNA，Real-time PCR檢測細胞內miR-209、MEK、ERK mRNA的表達；另取上述細胞，RIPA 裂解細胞，提取細胞總蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測p-MEK（抗體1∶100 稀釋）、p-ERK 蛋白（抗體1∶2 500 稀釋）的表達；CCK-8 法檢測miR-209 轉染對8 Gy 放療后膠質瘤U87 細胞增殖的影響：另取轉染miR-209、放療后膠質瘤U87 細胞，按照CCK-8 試劑盒說明加入試劑，培養24、48 h 后在酶聯免疫檢測儀450 nm 波長處測定每孔光密度（OD）值；另取mimics control 作為陰性對照組，照射后膠質瘤U87 細胞做空白對照組，每組實驗重復3 次。

1.4 統計方法采用SPSS 13.0 統計軟件對數據進行分析，計量資料采用（）表示，兩組間數據分析采用t檢驗；兩組以上數據采用單因素方差分析，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 放療后膠質瘤U87細胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達放療后膠質瘤U87 細胞中miR-209相對表達量為（0.09±0.02），低于放療前的（0.15±0.05），差異有統計學意義（t=2.491，P=0.037 4）。放療后膠質瘤U87 細胞中MEK mRNA 相對表達量為（0.38±0.11），低于放療前的（0.45±0.14），但差異無統計學意義（t= 0.879，P= 0.405 0）。相比于放療前ERK mRNA 的相對表達（0.36±0.09），放療后ERK mRNA 相對表達量為（0.27±0.09），差異無統計學意義（t=1.581，P=0.152 5，圖1）。

圖1 放療后膠質瘤U87 細胞中miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達Fig.1 The expression of miR-209，MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 after radiotherapy

2.2 轉染miR-209 對膠質瘤U87 細胞增殖、放療敏感性的影響miR-209 mimics 轉染U87 細胞后，miR-209相對表達高達（7.44±1.58），高于陰性對照組（0.10±0.03）和空白對照組（0.08±0.02），差異有統計學意義（F=106.5，P＜0.000 1），表明miR-209已成功轉染至U87 細胞內。miR-209 mimics 轉染后，MEK mRNA 表達減少至（0.11±0.05），與陰性對照組（0.40±0.18）和空白對照組（0.42 ± 0.15）差異有統計學意義（F=7.866，P=0.006 6），ERK mRNA表達減少，與其余兩組比較差異均有統計學意義（F= 9.891，P= 0.002 9，圖2）。miR-209 mimics 轉染U87 細胞后，p-MEK、p-ERK 表達均低于陰性對照組和空白對照組（圖3）。miR-209 mimics 轉染24、48 h，細胞增殖受到抑制，與陰性對照組和空白對照組比較均有統計學差異（F= 21.58，P＜0.000 1，圖4）。

圖2 miR-209 mimics 轉染膠質瘤U87 細胞經放療后miR-209、MEK、ERK mRNA 的表達Fig.2 The expression of miR-209，MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 transfected with miR-209 mimics after radiotherapy

圖3 miR-209 mimics 后膠質瘤U87 細胞中miR-209、MEK、ERK 蛋白的表達Fig.3 The protein expression of MEK and ERK mRNA in glioma cell line U87 transfected with miR-209 mimics after radiotherapy

圖4 miR-209 mimics 抑制膠質瘤U87 細胞增殖Fig.4 miR-209 mimics inhibit proliferation of glioma cell line U87

3 討論

膠質瘤是神經外科常見的腫瘤，其中膠質母細胞瘤在WHO 的分級中屬于高級別膠質瘤，具有高度增殖、侵襲的特點［6］，預期壽命不超過1年，5年生存率不足4%［7］。以手術為主、聯合放化療的綜合治療是目前膠質瘤主要治療方法［8］，但大部分患者手術難以完整切除，加之血腦屏障阻礙使得抗膠質瘤藥物在局部很難達到有效濃度［9］，而術后輔助放療可降低膠質瘤的復發率，延長生存期，是膠質瘤患者術后重要治療手段［10］。隨著放療劑量的累積，膠質瘤細胞出現損傷修復、細胞周期的再分布等原因使部分膠質瘤患者出現放療抵抗現象［11］，因此放療耐受機制的研究是目前膠質瘤高放療研究的重點。有研究發現多種基因、信號通路與放療抵抗密切相關［12］。

大量研究報道絲裂原細胞外信號調節激酶（mitogen extracellular signal regulated kinases，MEK）和細胞外信號調節激酶（extracellular signal regulated kinase，ERK）異常活化促進腫瘤發生發展，并與腫瘤化療耐藥、放療抵抗密切相關［13］。MEKERK 信號通路通過細胞表面受體信號傳導至細胞核內，參與多種病理過程，受上游RAS 癌基因家族調控，Ras 被刺激因子激活后，生長因子受體結合蛋白2（Grb2），作為接頭分子，與SOS（son of sevenless）的C 端富于脯氨酸的序列相互作用形成受體-Grb2-SOS 復合物，在Ras 附近形成高濃度的SOS，激活Ras，從而激活Ras-MEK-ERK 信號通路［14-15］。本研究發現，X 線照射膠質瘤U87 細胞后，MEK、ERK mRNA 表達沒有明顯變化，表明放療并不能刺激Ras-MEK-ERK 信號通路，亦或是膠質瘤U87細胞凋亡與Ras-MEK-ERK 信號通路激活共同作用結果，但miR-209 表達減少，通過瞬時轉染使膠質瘤U87 細胞內過表達miR-209 后，細胞的增殖明顯受到抑制，同時細胞內MEK、ERK 的轉錄和表達均明顯降低，表明miR-209 可能通過下調MEK-ERK信號通路增強膠質瘤U87 細胞放療敏感性，本實驗初步闡明腦膠質瘤U87 細胞內過表達miR-209對放療后細胞增殖的影響，表明微小microRNA 可能具有影響膠質瘤的放療敏感性的作用，但其具體機制仍待進一步研究探索，本研究為后續腦膠質瘤的后續臨床研究提供理論基礎。

綜上所述，miR-209 通過下調膠質瘤U87 細胞中MEK-ERK 的表達，能抑制細胞增殖，增強放療敏感性，為膠質瘤放療抵抗的機制研究提供新方向，同時為膠質瘤的綜合治療提供新的理論依據。