高效液相色譜-熒光檢測(cè)法測(cè)定保健食品中的維生素K1 和維生素K2

許強(qiáng)，孟凡達(dá)，王軼鵬，張志濤，王瑋，王郡甫

(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所,山東第一醫(yī)科大學(xué),濟(jì)南 250062)

維生素K 又稱凝血維生素,包含維生素K1、K2、K3、K4等4種形式,最早于1929年由丹麥化學(xué)家達(dá)姆從動(dòng)物肝臟和麻子油中發(fā)現(xiàn)。維生素K1、K2均為脂溶性化合物,屬于2-甲基-1,4-萘醌衍生物。維生素K1存在于綠色植物中,是食物中維生素K 的主要來源;維生素K2主要由腸道細(xì)菌合成。維生素K1、K2主要參與肝臟凝血酶原和其他凝血因子的合成,當(dāng)體內(nèi)缺乏時(shí)可造成凝血障礙[1-2],可用于預(yù)防和治療肝癌和白血病[3-7]。此外,它們也參與骨代謝和細(xì)胞生長(zhǎng),在預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松等方面的效果顯著[8-10]。因此,維生素K1和K2被廣泛添加于藥品和保健食品中,對(duì)這些產(chǎn)品中維生素K1和K2含量的測(cè)定意義重大。

目前維生素K1、K2的測(cè)定方法主要有高效液相色譜-紫外檢測(cè)法(HPLC-UV)、高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)和高效液相色譜-質(zhì)譜法(HPLC-MS)等[11-19]。以上方法各有優(yōu)缺點(diǎn),在微痕量組分分析時(shí),HPLC-UV 的選擇性和靈敏度相對(duì)較差;HPLC-MS靈敏度較高,但儀器昂貴,難以在基層實(shí)驗(yàn)室推廣,由于目前的檢測(cè)方法多為單項(xiàng)逐一檢測(cè),故建立一種同時(shí)測(cè)定維生素K1、K2的方法,能夠極大地降低試劑消耗、節(jié)省檢測(cè)時(shí)間,具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

在文獻(xiàn)[11-19]的基礎(chǔ)上,本工作在對(duì)保健食品軟膠囊樣品進(jìn)行簡(jiǎn)單的前處理后,采用鋅粉還原柱對(duì)樣品溶液中的維生素K1、K2進(jìn)行柱后化學(xué)衍生,使維生素K 同系物的母核萘醌環(huán)產(chǎn)生熒光,進(jìn)而可被高效液相色譜儀附帶的FLD 檢測(cè),該方法簡(jiǎn)單、高效,可為保健品中維生素K1、K2的測(cè)定提供技術(shù)參考。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀,配1200型熒光檢測(cè)器;Ultrasonic Cleaner 1730T 型超聲波發(fā)生器;鋅粉還原柱(50 mm×4.6 mm)。

維生素K1、K2單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:1 000 mg·L－1,分別稱取維生素K1、K2標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg,用甲醇溶解并定容于10.0 mL 棕色容量瓶中,搖勻后于4 ℃保存。

維生素K1、K2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:取適量維生素K1、K2單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇逐級(jí)稀釋配制成含有5,10,20,50,100μg·L－1維生素K1,20,40,80,200,400μg·L－1維生素K2的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,搖勻后于4 ℃保存。配制過程注意避光。

甲醇、四氫呋喃為色譜純;冰乙酸、氯化鋅、無水乙酸鈉為分析純;試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器工作條件

SB-C18色譜柱(4.6 mm×150 mm,5μm);柱溫35 ℃;流量1.0 mL·min－1;進(jìn)樣量10μL;流動(dòng)相為含11 mmol·L－1氯化鋅,6 mmol·L－1乙酸鈉,0.03%(體積分?jǐn)?shù),下同)乙酸,10%(體積分?jǐn)?shù),下同)四氫呋喃的90%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲醇溶液;等度洗脫;熒光激發(fā)波長(zhǎng)243 nm,發(fā)射波長(zhǎng)430 nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取1.00 g 樣品,加入8 mL 異丙醇后,在80 W 功率下超聲10 min,靜置冷卻至室溫,用異丙醇定容至10 mL,溶液過0.22μm 濾膜,濾液置于棕色進(jìn)樣瓶中,按儀器工作條件測(cè)定。試驗(yàn)過程注意避光。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件對(duì)維生素K1、K2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液進(jìn)行測(cè)定,色譜圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液的色譜圖Fig.1 Chromatograms of mixed standard solution and sample solution

由圖1可知:維生素K1、K2的色譜分離效果較好,且樣品溶液中其他雜質(zhì)不干擾目標(biāo)物的測(cè)定。

2.2 溶解試劑的選擇

維生素K1、K2為脂溶性維生素,而相關(guān)保健食品多以大豆油為基質(zhì),故試驗(yàn)選擇以異丙醇、正己烷和甲醇作為溶解試劑,并按照試驗(yàn)方法考察了其對(duì)實(shí)際樣品的溶解效果。結(jié)果顯示:以甲醇作溶解試劑時(shí),樣品溶液會(huì)出現(xiàn)分層現(xiàn)象,其他兩種溶劑的溶解效果均較好。考慮到正己烷易對(duì)反相色譜柱造成損害,故試驗(yàn)選擇異丙醇作溶解試劑。

2.3 干擾試驗(yàn)

選擇同樣以大豆油為基質(zhì)的含有維生素A、維生素D 和維生素E 的保健食品軟膠囊作為干擾試驗(yàn)樣本,分別加入維生素K1、K20.1,0.4μg,按照試驗(yàn)方法測(cè)定。結(jié)果顯示:K1和K2測(cè)定值相對(duì)誤差的絕對(duì)值不大于5%,說明維生素A、維生素D 和維生素E對(duì)維生素K1、K2的測(cè)定無影響。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按照儀器工作條件對(duì)維生素K1、K2混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,以兩者的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明:維生素K1的線性范圍為5～100μg·L－1,線性回歸方程 為y＝8.706x＋0.1114,相關(guān)系數(shù)為0.999 7;維生素K2的線性范圍為20～400μg·L－1,線性回歸方程為y＝9.052x＋1.452,相關(guān)系數(shù)為0.999 8。

以3倍、10倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N)和測(cè)定下限(10S/N)。結(jié)果表明:維生素K1、K2的檢出限分別為0.03,0.06μg·L－1,測(cè)定下限分別為0.10,0.20μg·L－1。

2.5 精密度與回收試驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)陰性樣品進(jìn)行低、中、高等3種濃度水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定6次,計(jì)算維生素K1、K2的回收率和測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

由表1可知:維生素K1和維生素K2的回收率為95.7%～101%,RSD 為1.8%～4.1%,表明該方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

2.6 樣品分析

按試驗(yàn)方法分析某企業(yè)提供的分別含維生素K1和維生素K2的兩種軟膠囊類保健食品。結(jié)果顯示,維生素K1和維生素K2的檢出量分別為32.50,39.27μg·g－1,與維生素K1標(biāo)示量(不小于30μg·g－1)和維生素K2標(biāo)示量(不小于35μg·g－1)一致。

本工作建立了HPLC-FLD 測(cè)定保健食品軟膠囊中維生素K1、K2含量的方法,該方法分離效果好、靈敏度高,精密度和準(zhǔn)確度均較好,可滿足保健食品檢測(cè)工作的需求。