PPARγ/UCP2在甲醛致學習記憶障礙中的作用

鄭麗芳,蕭嘉莉,袁佩昕,陳泊岐,梅 瓊,池煜瑤,呂 柯,李 睿

PPARγ/UCP2在甲醛致學習記憶障礙中的作用

鄭麗芳,蕭嘉莉,袁佩昕,陳泊岐,梅 瓊,池煜瑤,呂 柯,李 睿*

(華中師范大學生命科學學院,遺傳調控與整合生物學湖北省重點實驗室,湖北 武漢 430079)

為探究過氧化物酶體增殖物激活受體γ/解偶聯蛋白2(PPARγ/UCP2)在甲醛(FA)誘導的學習記憶障礙中的作用,本文將C57BL/6小鼠隨機分為:對照組、T0070907組(抑制劑組)、3mg/m3 FA組、3mg/m3 FA+T0070907組,進行連續21d的實驗暴露,在第22d取腦組織測定腦組織臟體比并勻漿,檢測活性氧(ROS)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、核因子κB()、白細胞介素6(IL-6)、PPARγ、UCP2等生化指標,通過Nissl染色觀察腦組織的病理學變化.結果發現,與對照組相比,T0070907組和3mg/m3 FA組小鼠大腦皮層神經元受損,GSH含量下降,ROS、MDA、、IL-6含量有所上升,而3mg/m3 FA+T0070907組小鼠上述現象更嚴重.此外,與對照組相比,T0070907組小鼠腦組織中的PPARγ和UCP2含量下降,但3mg/m3 FA組小鼠腦組織中的PPARγ和UCP2含量上升;與3mg/m3 FA組相比,加入抑制劑的3mg/m3 FA+T0070907組小鼠腦組織中的PPARγ和UCP2含量下降.研究結果表明,在加入PPARγ抑制劑后,PPARγ/UCP2含量下降,加重了FA所致小鼠的學習記憶障礙,故PPARγ/UCP2在FA致學習記憶障礙中可能起保護作用.

甲醛；記憶功能；氧化損傷；炎癥

甲醛(FA)是一種常見的室內空氣污染物,作為全球最大的FA生產與消費國,我國所面臨的FA污染形勢嚴峻[1].調查顯示,在家具木材廠、服裝皮革廠以及大部分醫院取材室工作的人員可長期暴露在濃度高達1.31～6.25mg/m3的FA中[2-4].研究表明,中樞神經系統是受到FA影響的重要系統之一[5].FA可導致腦部氧化應激反應,甚至會增加諸如阿爾茨海默癥、帕金森等神經性疾病的發病幾率[6],受到人們的廣泛關注.流行病學數據顯示,長期接觸高水平FA的組織學技術人員和工作人員會出現行為和神經癥狀[7].動物實驗研究發現,FA對小鼠具有神經毒性,能降低小鼠的學習記憶能力,導致腦組織發生病理損傷[8].

解偶聯蛋白家族(UCPs)是一類位于線粒體內膜的載體蛋白,可以通過引起質子泄漏來解偶聯線粒體呼吸產生的ATP,也可以參與能量平衡的調節,在維持線粒體功能方面具有重要作用.其中,解偶聯蛋白2(UCP2)可在大腦、皮膚、肝臟、腎臟等器官和組織中表達[9].有研究表明,氰化物誘導的氧化應激可導致腦中UCP2的激活和上調[9].此外,UCP2可參與神經元活動的調節,并且可通過抑制活性氧(ROS)的生成和參與ROS的清除緩解線粒體功能障礙,預防腦外傷后神經元凋亡,減少腦功能障礙的發生[10].UCP2是過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)的下游靶基因,PPARγ是調節目標基因表達的核內受體轉錄因子超家族成員之一,可調節下游UCP2的表達[11]. T0070907為PPARγ有效的特異性抑制劑,其可通過影響PPARγ中配體結合的第12螺旋區域結構來調節PPARγ及其下游基因的表達[12].

目前,對PPARγ/UCP2的研究多集中在肝臟、心血管、胃、肥胖、糖尿病等方面,但對于PPARγ/UCP2在學習記憶障礙發生發展中的作用研究較少.本實驗探究PPARγ/UCP2在FA誘導的學習記憶障礙中的作用,旨在為確定相關的藥物治療靶點提供參考,為探究緩解FA所致神經毒性的方法提供參考.同時,由于線粒體相關蛋白是細胞進行正常生命活動的重要成分,本實驗研究結果可能為線粒體蛋白的更多相關疾病發生發展提供參考,為其他疾病的研究打下基礎.

1 材料與方法

1.1 實驗動物

采用SPF級(無特定病原體動物)雄性C57BL/6小鼠(5～6周齡,(19±2) g),購于湖北省疾病預防控制中心.購置的小鼠在華中師范大學生命科學學院SPF級實驗動物中心繼續飼養1周,飼養環境為標準的屏障環境,溫度設定為20～25℃,相對濕度維持在50%～60%,光暗循環周期為12h.

1.2 主要實驗試劑與儀器

福爾馬林(10%, Sigma);2’,7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA熒光染料,純度399.9%, Sigma);谷胱甘肽(GSH)試劑盒(南京建成生物工程研究所);小鼠白細胞介素6(IL-6)酶聯免疫吸附(ELISA)試劑盒(Bio-Swamp);PPARγ抑制劑T0070907(MCE);小型環境智能氣候艙(WH-2, 武漢宇信);甲醛測定儀(MEF50型,思樂智);全波長酶標儀(DNM-9602).

1.3 實驗方法

將實驗小鼠隨機分為4組,分別為:A:(對照組), B:(T0070907組), C:(3mg/m3 FA組), D:(3mg/m3 FA+T0070907組).FA暴露采用動態吸入式染毒(3mg/m3,8h/d).T0070907:先加入DMSO對T0070907粉末進行促溶,然后加入所需體積的生理鹽水配置成0.1mg/mL的T0070907溶液,采用腹腔注射處理(1mg/(kg×d)).

Morris水迷宮主要應用于嚙齒類動物學習和記憶能力的研究.本實驗參照Lu等[13]實驗中的方法進行Morris水迷宮實驗,由Smart 3.0軟件收集數據.染毒第15～19d為定向航行實驗;第20d只暴露,作為小鼠遺忘期;第21d進行空間探索實驗以檢測小鼠的記憶能力.

1.4 檢測方法

在各處理第22d頸椎脫臼法處死小鼠,取出腦組織,漂洗干凈,脫水,加入磷酸鹽緩沖液(PBS)后研磨,制備成10%的組織勻漿液,離心,取上清,分裝,冷凍于-80 ℃冰箱中儲存備用.

1.4.1 小鼠腦組織病理學檢測 取腦組織,漂洗干凈后,固定過夜,脫水,透明,包埋,切片,粘片,脫蠟,然后進行Nissl染色,再脫水,透明和封片,最后在顯微鏡下觀察、采集圖片.

1.4.2 生物指標測定 采用DCFH-DA法檢測活性氧(ROS)含量,具體操作為:腦勻漿稀釋25倍后,加入酶標板中與0.2μmol/LDCFH-DA熒光染料避光孵育,放入酶標儀在485nm激發光,525nm發射光的條件下測定熒光強度.采用硫代巴比妥酸(TBA)法檢測丙二醛(MDA)含量,具體操作為:腦勻漿加入0.6% TBA溶液后沸水浴,離心,取上清液于酶標板中,放入酶標儀在450,532和600nm波長下測定吸光度.采用谷胱甘肽(GSH)試劑盒檢測腦組織中GSH含量.采用ELISA法檢測白細胞介素6(IL-6)含量,具體方法參照說明書.

1.4.3 熒光定量PCR 采用TRIzol法提取0.1g腦組織中的RNA,之后用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(Vazyme)試劑盒進行逆轉錄得到cDNA.最后用ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Vazyme)試劑盒并按照其程序進行qPCR檢測-κB和-(內參)基因的表達,基因的引物設計如表1所示.

表1 引物序列

1.4.4 免疫組化檢測 采用免疫組化法檢測PPARγ、UCP2的蛋白表達量.將石蠟切片去石蠟并水化,用0.3%過氧化氫孵育并用適當的正常血清封閉.使用抗RRARγ和抗UCP2作為一抗,然后加入二抗和顯色劑二氨基聯苯胺(DAB),進行復染、脫水、透明、封片,陰性對照不加入一抗.鏡下觀察、拍照,使用Image-Pro Plus 6.0軟件獲得平均光密度.

1.5 統計學方法

結果以平均值±標準差(Mean±SD)表示,用Origin 8.5軟件分析實驗數據并生成統計圖.水迷宮定向航行實驗數據采用重復測量的方差分析,隨后采用T檢驗做兩兩比較.其他數據采用單因素方差分析,隨后采用T檢驗多重比較檢驗組間均值的差異顯著性,顯著水平定為<0.05.

2 結果分析

2.1 Morris水迷宮實驗

如圖1(a)和1(b)所示,與對照組相比,T0070907組小鼠和3mg/m3FA組小鼠的平均潛逃時間增加,潛逃時間變化減慢.與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+T0070907組小鼠平均潛逃時間增加,潛逃時間變化減慢.

圖1(c)表示小鼠在第21d空間探索實驗中的游泳路徑,顯示出對照組小鼠游泳路徑集中在原平臺所在象限(即NW象限),具有方向性和目的性.而T0070907組和3mg/m3FA組小鼠游泳路徑沒有目的性,且缺乏規律性;與3mg/m3FA組小鼠游泳路徑相比,3mg/m3FA+T0070907組小鼠游泳路徑更加雜亂.

(c) 第21d游泳軌跡

圖1 小鼠水迷宮實驗結果

Fig.1 Results of the water maze test of mice

2.2 腦組織病理學檢測

如圖2所示,FA暴露對小鼠腦組織海馬區產生了一定的影響.對照組小鼠腦組織海馬CA3區神經元細胞數目多,形態結構清晰,排列整齊.而T0070907組和3mg/m3FA組小鼠腦組織海馬CA3區神經元受到不同程度的損傷,其細胞數目減少,形態發生變化且排列雜亂.與3mg/m3FA組相比, 3mg/m3FA+T0070907組小鼠腦組織海馬CA3區受損更為嚴重.

圖2 各組小鼠腦組織Nissl染色

2.3 小鼠體重變化及腦組織臟體比變化

如圖3(a)所示,小鼠每天自由進食和飲水,體重逐漸增加.與對照組相比,T0070907組小鼠和3mg/ m3FA組小鼠體重增量較少,3mg/m3FA+ T0070907組小鼠體重增量更少.與3mg/m3 FA組小鼠相比, 3mg/m3FA+T0070907組小鼠體重增量減少.

臟體比又稱臟器系數,是動物某臟器的質量與其體重的比值.如圖3(b)所示,與對照組相比, T0070907組和3mg/m3FA組小鼠腦組織臟體比增加,無統計學意義;3mg/m3FA+T0070907組小鼠腦組織臟體比增加,具有極顯著統計學意義(<0.01).與3mg/m3 FA組相比,3mg/m3FA+T0070907組小鼠腦組織臟體比增加,具有顯著統計學意義(< 0.05).

2.4 腦部氧化損傷指標檢測結果

2.4.1 ROS水平 ROS為活性氧自由基,過量的自由基將會對機體造成損傷.如圖4(a)所示,與對照組相比,T0070907組和3mg/m3FA組小鼠ROS含量升高,差異極其顯著(<0.0001).與3mg/m3FA組相比, 3mg/m3FA+T0070907組ROS含量升高,具有顯著統計學意義(<0.05).

2.4.2 MDA含量 生物體內,自由基作用于脂質發生過氧化反應,氧化終產物為MDA,會引起蛋白質、核酸等生物大分子的交聯聚合造成損傷.如圖4(b)所示,與對照組相比,T0070907組和3mg/m3FA組小鼠MDA含量上升,無統計學意義;3mg/m3FA+ T0070907組MDA含量升高,具有顯著統計學意義(<0.05).與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+ T0070907組MDA含量升高,無統計學意義.

2.4.3 GSH含量 GSH能幫助保持正常的免疫系統功能,并具有抗氧化、整合解毒等作用.如圖4(c)所示,與對照組相比,3mg/m3FA組GSH含量降低,無統計學意義;3mg/m3FA+T0070907組GSH含量降低,具有極顯著統計學意義(<0.01).與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+T0070907組GSH含量降低,具有極顯著差異(<0.01).

** :<0. 01,與A組相比;&:<0.05,與C組相比

2.5 腦部炎癥相關因子

2.5.1基因表達水平參與細胞對外界刺激的響應,在細胞的炎癥反應、免疫應答等過程中起到關鍵性作用.的錯誤調節會引發自身免疫病、慢性炎癥以及很多癌癥.如圖5(a)所示,與對照組相比,T0070907組小鼠腦組織中水平下降,3mg/m3FA組小鼠腦組織中水平上升,無統計學意義.與3mg/m3FA組相比,3mg/ m3FA+T0070907組小鼠腦組織含量上升,無統計學意義.

* :<0.05,**:<0.01,****:<0.0001,與A組相比;&:<0.05, &&:<0.01,與C組相比

*<0.05,**<0.01,與A組相比

2.5.2 IL-6含量 IL-6是一種生物學活性非常廣泛的細胞因子,機體有炎癥時,IL-6升高.如圖5(b)所示,與對照組相比,T0070907組和3mg/m3FA組IL-6含量上升,具有顯著統計學意義(<0.05或<0.01),與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+T0070907組IL-6含量上升,無統計學意義.

2.6 PPARγ和UCP2含量

2.6.1和基因表達量 如圖6(a)所示,與對照組相比,T0070907組小鼠腦組織中基因表達量有所下降,而3mg/m3FA組小鼠腦組織中基因表達量有所上升,無統計學意義.與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+ T0070907組小鼠腦組織中的基因表達量下降,無統計學意義.如圖6(b)所示,與對照組相比,T0070907組小鼠腦組織中基因表達量下降,3mg/m3FA組小鼠腦組織中基因表達量上升,具有顯著統計學意義(<0.05).與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+ T0070907組小鼠腦組織中的基因表達量下降,具有顯著統計學意義(<0.05).

2.6.2 PPARγ和UCP2蛋白表達量 如圖7所示,與對照組相比,T0070907組小鼠腦組織海馬區PPARγ(圖7(a)和7(b))和UCP2(圖7(c)和7(d))蛋白水平下降,具有極顯著統計學差異(< 0.0001).而3mg/m3FA組小鼠腦組織海馬區中PPARγ(圖7(a)和7(b))和UCP2(圖7(c)和7(d))蛋白水平上升,具有極顯著統計學差異(<0.0001).與3mg/m3FA組相比,3mg/m3FA+T0070907組小鼠腦組織海馬區PPARγ(圖7(a)和7(b))和UCP2(圖7(c)和7(d))蛋白水平明顯下降,差異性極其顯著(<0.0001).

圖6 各組小鼠腦組織PPARγ和UCP2qPCR結果

*<0.05,與A組相比; &:<0.05,與C組相比

圖7 各組小鼠海馬區PPARγ和UCP2 免疫組化結果

****<0.0001,與A組相比; &&&&:<0.0001,與C組相比

3 討論

對于FA職業暴露人員,其所接觸的FA大部分以吸入方式為主[14],故本實驗使用WH-2小型智能環境氣候艙以氣態暴露吸入式對小鼠進行濃度為3mg/m3FA暴露,此濃度較符合職業場所現實暴露情況[15-16].有研究表明,1周的老鼠壽命大約相當于人1年的生命[17],故本實驗模擬職業人員暴露于高水平FA長達3年時間.

3.1 FA對小鼠學習記憶能力的影響

Morris水迷宮實驗可以通過定向航行和空間探索實驗觀察實驗動物的學習情況,客觀地反映其學習記憶能力.海馬在腦內擔當著關于記憶以及空間定位的作用.Huang等[18]研究發現FA可導致小鼠海馬組織受損,學習記憶能力下降.本研究表明,與對照組相比,3mg/m3FA組小鼠在前5d的定向航行實驗中,平均逃逸時間增加,游泳路徑大多無目的性且不規則,表明其學習記憶能力下降.病理學檢測結果表明,3mg/m3FA組小鼠腦組織海馬CA3區神經元受到損傷,其細胞數目減少,排列雜亂,尼氏體數目減少.因此,3mg/m3FA暴露導致的小鼠學習記憶能力下降可能與其引起的海馬組織受損有關.

3.2 FA對小鼠腦組織的氧化損傷和炎癥反應

有研究表明神經功能缺失后,腦組織臟體比和腦含水量明顯上升[19],說明腦組織臟體比可以在一定程度上反映腦部損傷程度.本實驗中的3mg/m3FA組小鼠腦部發生水腫,從而導致腦組織臟體比上升,說明FA染毒使小鼠腦部受到了一定的損傷.

FA可以通過增加機體內自由基和脂質過氧化,導致脂質過氧化產物MDA含量的增加,從而降低機體不同器官中的超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶及GSH的含量[20].魯嫻嫻等[21]研究表明,使用FA單獨染毒哮喘小鼠,可致小鼠肺部MDA水平顯著升高(<0.001).安潔然等[22]的研究表明,對Balb/c小鼠進行FA的染毒,可以使小鼠肝臟和腎臟的ROS、MDA含量上升、GSH含量下降,出現顯著性差異(<0.05或<0.01).本研究數據表明, 3mg/m3FA暴露可以使小鼠腦組織中的ROS含量增加,可見高濃度、長時間的FA暴露可以加重小鼠腦組織的氧化應激水平,促進ROS代謝反應的進行,從而對細胞內的大分子物質進行破壞.3mg/m3FA暴露的小鼠MDA的含量也有所增加,可見FA的暴露使機體脂質過氧化產物增多,機體的抗氧化能力降低,從而造成細胞的氧化性損傷.而GSH檢測結果呈現出3mg/m3FA暴露的小鼠GSH含量下降的趨勢,因此GSH在小鼠機體中消耗巨大,細胞的抗氧化能力降低.以上結果與陸林潔等[23]研究發現結果一致,FA可以導致小鼠腦部產生氧化損傷.

此外,FA可以引起中樞神經系統(CNS)的嚴重損傷,導致腦部炎癥.Sorg等[24]研究發現,經FA連續暴露的大鼠腦部出現炎癥,且最終導致了中樞神經系統的電路敏感.本實驗表明,3mg/m3FA暴露可以使小鼠腦組織中的和IL-6含量增加,表明小鼠的腦組織出現了炎癥反應.這同樣與陸林潔等[23]研究發現結果一致.由此可見,FA的暴露可以介導炎癥反應,從而對小鼠的腦組織產生損傷.

3.3 PPARγ/UCP2的作用

目前,關于PPARγ/UCP2的研究多集中在其參與調節脂肪細胞增殖分化、脂質代謝等多種生理過程,但其在中樞神經系統中也有表達,可參與神經系統疾病的發生發展過程[25-26].本研究發現,PPARγ/ UCP2在小鼠腦組織中有所表達,參與FA致小鼠學習記憶障礙的過程.

當細胞或生物體受到外界刺激后,可上調PPARγ/UCP2的表達[27],如全氟辛烷磺酸可上調大鼠胚胎神經干細胞中PPARγ/UCP2的表達,同樣發現在產前暴露于全氟辛烷磺酸后的小鼠新生兒大腦中也檢測到PPARγ和UCPs基因的表達明顯升高[28].本研究發現,經FA暴露后的3mg/m3 FA組小鼠腦中PPARγ和UCP2的表達均上調.此外,PPARγ途徑是一條氧化應激—敏感通路,ROS可通過激活MCF-7細胞的PPARγ信號途徑,引起細胞增殖調控相關基因的蛋白表達水平發生明顯變化[29];谷氨酸損傷也可引起神經元PPARγ的表達增加,該作用可能是與氧化應激有關的一種神經元自我保護性反應[30].同樣,氟化鈉、納米ZnO也可通過氧化應激上調UCP2的表達,產生應激反應[31-32].在本研究中,與對照組相比,3mg/m3 FA組小鼠腦中ROS含量和PPARγ/UCP2含量均上升,推測可能的機制是小鼠腦組織在受到FA刺激后氧化應激水平上升,進而激活了PPARγ/UCP2的表達,以保護FA所致腦損傷和學習記憶功能障礙(圖8).

圖8 PPARγ/UCP2保護FA致學習記憶障礙的潛在機制

T0070907為PPARγ的特異性抑制劑,可通過抑制PPARγ的表達從而抑制其對下游靶基因的調節[33],造成腦組織損傷的加重[34].Li等[35]研究表明,當PPARγ的表達被抑制后可加重HgCl2造成的腎毒性.本研究結果顯示,相較于3mg/m3 FA組,3mg/m3 FA+T0070907組小鼠腦組織中PPARγ/UCP2表達量下降,小鼠腦組織氧化應激水平升高,腦部炎癥加重,學習記憶障礙更加嚴重.因此,使用PPARγ抑制劑T0070907后可加重FA致小鼠學習記憶功能障礙和腦部損傷反應,這符合Huang等[10]的研究結果.即PPARg/UCP2在FA致學習記憶功能障礙中可能被上調,起應激保護作用.

4 結語

綜上所述,本研究表明濃度為3mg/m3的FA會造成小鼠學習記憶功能障礙,且小鼠腦部產生的氧化應激可能會上調PPARγ/UCP2的表達;抑制PPARγ/UCP2可加重FA致小鼠學習記憶功能障礙,故PPARγ/UCP2在FA致學習記憶障礙中可能起應激保護作用,其可作為線粒體功能障礙的治療靶點緩解神經毒性,但相關作用機制仍需進一步探索.

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Role of the PPARγ/UCP2 in learning and memory impairment induced by formaldehyde.

ZHENG Li-fang, XIAO Jia-li, YUAN Pei-xin, CHEN Bo-qi, MEI Qiong, CHI Yu-yao, LV Ke, LI Rui*

(Key Laboratory of Genetic Regulation and Integrated Biology of Hubei Province, School of Life Sciences, Central China Normal University, Wuhan 430079, China)., 2021,41(6)：2923～2931

To investigate the possible role of peroxisome proliferators-activated receptor γ/uncoupling protein 2(PPARγ/UCP2) in learning and memory impairment induced by formaldehyde(FA), C57BL/6 mice were randomly divided into different groups including control group, T0070907group(inhibitor group), 3mg/m3 FA group, 3mg/m3 FA+T0070907 group. After 21 days of continuous exposure to FA or other treatments in the experiment, mouse brain tissue was taken to determine brain index and before being homogenized for the detection of a series of physiological indices such as reactive oxygen species(ROS), glutathione(GSH), malondialdehyde(MDA), nuclear factor κB(-), interleukin-6(IL-6), PPARγ, UCP-2, as well as the determination of pathological changes by observing the Nissl stained brain tissue. The results showed that compared with those of mice in the control group, the cerebral cortex neurons of the mice were damaged in the T0070907group and the 3mg/m3FA group, the content of GSH decreased, and the levels of ROS, MDA,-, and IL-6 increased, with even more severe results were found in mice from the 3mg/m3FA+T0070907 group. In addition, compared with the control group, the contents of PPARγ and UCP2 decreased in the brain tissue of mice in the T0070907 group, while increased in those from the 3mg/m3FA group; compared with those of mice from the 3mg/m3FA group, the contents of PPARγ and UCP2 decreased in the brain tissue of mice from the 3mg/m3FA+T0070907 group after the inhibitor was administered. The content of PPARγ/UCP2 decreased after addition of T0070907, the inhibitor of PPARγ, which aggravated the learning and memory impairment in mice induced by FA exposure, therefore PPARγ/UCP2 may be protective to mice from the learning and memory impairment induced by FA.

formaldehyde；learning and memory；oxidative damage；inflammation

X18

A

1000-6923(2021)06-2923-09

鄭麗芳(1996-),女,山西應縣人,華中師范大學碩士研究生,研究方向為環境分子生物醫學.發表論文1篇.

2020-11-19

國家自然科學基因項目(21103059);科技部十三五國家重點研發計劃項目(2017YFC0702700)

* 責任作者, 教授, ruli@mail.ccnu.edu.cn