低頻變化電場促進細胞定向移動的研究*

李穎，Bing Song，殷濤，劉志朋△

(1.中國醫學科學院北京協和醫學院生物醫學工程研究所，天津 300192；2.中國科學院深圳先進技術研究院生物醫學與健康工程研究所轉化醫學研究與發展中心，深圳 518055)

1 引 言

細胞通過響應電、化學、機械等信號實現定向移動[1]，而電信號引導的細胞遷移對傷口愈合至關重要[2-3]。1794年，Galvani用青蛙坐骨神經斷端引起對側大腿肌肉收縮，開啟了神經電生理研究的序幕，但同時期電刺激治療的濫用和檢測設備的缺乏阻礙了損傷電位研究的發展[4]。二十世紀七十年代，Borgens等[5]發現在愈合過程中，蠑螈斷肢周圍的生物電流變化明顯。隨后，研究人員分別在哺乳動物[6]以及人類皮膚[7]中發現了經上皮電位，并證實其能夠加速上皮形成并促進結締組織遷移[8]。二十世紀九十年代，Nishimura等[9]和Zhao等[10]發現細胞在外加電場作用下發生定向移動，該現象稱為細胞趨電性(Galvanotaxis或Electrotaxis)。2006年，Zhao等[11]指出外加電場可激活Src和肌醇-磷酯信號通路，通過基因手段調控PI3K和PTEN通路可調節細胞趨電性，進而影響傷口愈合過程。近年來，研究發現與細胞趨電性有關的因素有電場的波形[12]、強度[3-14]、梯度[15]和頻率[16]，以及聚合物粘度[17]、胞外ATP[18]和基質特性[19-20]等，而在機制研究方面涉及蛋白表達[21]、Ca2+入涌[22]、肌動蛋白、VGSC[23]和CMF[24]、DIF[25]、Na+轉運[26]、ADAM17[27]、PMPD[28],以及干細胞療法[29]與癌癥發展[30-31]等。

眾多細胞，如角膜上皮細胞、神經元和脊髓細胞，角化細胞和阿米巴細胞等，在直流電場下能夠向負極移動，另外一些細胞，如乳腺癌、肺腺癌細胞、真皮成纖維細胞、Schwann 細胞等能夠向正極移動[32-33]。另一方面，多種非直流電場都能夠在臨床上有效促進傷口愈合[34-35]，且具有更小的電化學反應和細胞毒性[36]。我們的前期研究[37]證實，脈沖直流電場和雙極性脈沖電場都能促進細胞定向遷移：90%占空比脈沖直流電場和80%雙極性脈沖電場比直流電場更好，而電中性脈沖電場下細胞雖運動方向隨機而遷移速率卻最高。然而，該研究局限于脈沖波電場，并未涉及其他波形的非直流電場。基于此，本研究設計能產生連續變化波形的BME-A500電刺激器，在趨電性小室中分別產生10、5、1 Hz的正弦波、三角波和斜坡波電場，以延時攝影系統記錄電場下阿米巴細胞的運動影像，追蹤細胞運動軌跡并分析對比其運動特性。

2 材料和方法

2.1 電刺激器的設計及波形實現

與前期研究中BME-P500脈沖電刺激儀[37]不同，本研究的電刺激器用于在趨電性小室產生非脈沖波形的非直流電場，波形設定為斜坡、正弦波、三角波等。設計了BME-A500型電刺激儀，包含電源電路和信號放大電路兩個部分，見圖1。實驗中電場參數見表1，電場名稱中S、T、R分別表示正弦波、三角波和斜坡波，A、B、C分別表示頻率為10、5、1 Hz；f表示頻率(單位Hz)，t表示周期(單位s)，VH表示最高電壓(單位V)，VL表示最低電壓。由于小室中蓋玻片橋長度為1 cm，因此，本研究電場峰值為10 V/cm。

圖1 電刺激設備原理圖

表1 電場參數設定

2.2 細胞培養、軌跡追蹤和數據分析

阿米巴細胞(AX2，野生型)在21 ℃陰涼柜的培養皿中培養，隨后在搖床上大量培養。控制足夠數量，用cAMP溶液刺激4 h[37]。制作趨電性小室，與緩沖、鹽橋和電刺激器構成回路，細胞注入小室20 min后施加電場開啟延時攝影[37]。細胞的追蹤以及軌跡呈現使用ImageJ，以導向性(cos θ)和遷移速率(單位μm/min)衡量細胞趨電性[37-38]。本研究數據統計方法為單因素方差分析，無對照組的兩兩比較使用Tukey法，有對照組的使用Dunnet方法。

3 結果

3.1 不同頻率正弦波電場下細胞運動特性對比

為了研究不同頻率正弦波電場下細胞的運動特性，使用上述電刺激器在趨電性小室中施加10、5、1 Hz正弦波，分別得到相應的細胞運動軌跡，見圖2。對三種電場下的細胞導向性進行方差分析，發現三者間具有顯著差異(P<0.01)，說明正弦波電場的頻率變化對細胞導向性具有影響，組間對比發現5 Hz與1 Hz電場下細胞導向性具有顯著差異(P<0.01)：細胞在5 Hz具有更高的方向特性。對比三者遷移速率：10 Hz(17.02±3.33，n= 240)、5 Hz(17.72±3.56，n=240)、1 Hz(17.62±3.09，n=240)，發現具有統計學差異(P<0.05)，說明頻率變化對其遷移速率具有影響，但組間兩兩對比沒有明顯差異(SA對SB=ns，SA對SC=ns，SB對SC=ns；ns即P>0.05)。綜合考慮，5 Hz正弦波電場下細胞趨電性最好。

3.2 不同頻率三角波電場下細胞運動特性對比

為了研究不同頻率三角波電場下細胞的運動特性，使用上述電刺激器在趨電性小室中施加10、5、1 Hz三角波，分別得到相應的細胞運動軌跡，見圖3。

注：圖中正負號分別代表實驗電極正負極，箭頭表示電場方向，正電極位于趨電性小室的左側或右側由實驗次序決定。**P < 0.01。

圖3 三角波電場下細胞運動分析

對三種電場下的導向性進行方差分析，發現不具有統計學差異(ns)，說明三角波電場的頻率變化對導向性無影響，而組間對比發現也不具有統計學差異(ns、ns、ns)。對比三者遷移速率：10 Hz(16.83±3.80，n=240)、5 Hz(18.63±3.36，n=240)、1 Hz(14.78±3.48，n=240)，發現具有統計學差異(P<0.001)，說明三角波電場的頻率變化對遷移速率具有影響；組間兩兩對比都具有明顯差異(P<0.001，P<0.001，P<0.001)，說明5 Hz三角波電場下細胞運動最快。綜合考慮，5 Hz三角波電場下細胞趨電性最好。

3.3 不同頻率斜坡波電場下細胞運動特性對比

為了研究不同頻率斜坡波電場下細胞的運動特性，使用上述電刺激器在趨電性小室中施加10、5、1 Hz斜坡波，分別得到相應的細胞運動軌跡，見圖4。對三種電場下的導向性進行方差分析，發現具有統計學差異(P<0.001)，說明斜坡電場的頻率變化對導向性具有影響，且組間分析發現10 Hz對比5 Hz和1 Hz分別具有顯著差異(P<0.001，P<0.001，ns)，說明10 Hz斜坡波的導向性最小。對比三者遷移速率：10 Hz(18.93±4.16，n=240)、5 Hz(19.28±3.30，n=240)、1 Hz(18.49±3.24，n=240)，發現無顯著差異(ns)，說明斜坡波電場的頻率變化對遷移速率不具有影響，但組間對比發現5 Hz和1 Hz電場下細胞遷移速率具有顯著差異(ns，P<0.05，ns)，說明細胞在5 Hz斜坡波比1 Hz運動更快。綜合考慮，5 Hz斜坡波下細胞趨電性最好。

注：***P < 0.001。

3.4 三種波形最優場與直流電場和脈沖電場下細胞運動特性對比

為了從以上三種波形中選擇最優波形，以前期研究[37]中直流電場和50%占空比脈沖電場下細胞運動特性作為對照組，見表2，其中50%占空比脈沖電場下細胞與直流電場相比，導向性較小，遷移速率較慢。發現以直流電場的導向性為對照組，三種波形與之相比，具有顯著差異(P<0.001)，且5 Hz三角波明顯劣于直流電場對照組(SB對直流電場對照組= ns，TB對直流電場=P<0.01，RB對直流電場= ns)；同時以直流電場的遷移速率為對照組，三種波形與之相比，具有顯著差異(P<0.001)，且5 Hz斜坡波明顯優于直流電場對照組(ns，ns，P<0.001)。以脈沖電場的導向性為對照組，三種波形與之相比，也具有顯著差異(P<0.001)，且5 Hz斜坡波明顯優于脈沖電場對照組(ns，ns，P<0.001)；同時以脈沖電場的遷移速率為對照組，三種波形與之相比，具有顯著差異(P<0.001)，且三種波形均優于對照組(P<0.001，P<0.001，P<0.001)。

表2 本研究三組不同波形電場中最優與直流電場和脈沖電場下細胞運動特性對比

綜上，由導向性和遷移速率兩方面考慮，5 Hz斜坡波電場下細胞具有最優的趨電性。

4 討論和結論

本研究設計并制作了能產生連續變化電場的電刺激器，用于在趨電性小室中產生三種不同頻率的三種非直流電場波形，記錄、分析和對比阿米巴細胞在不同電場下的運動特性。結果發現正弦波、三角波和斜坡波電場下，5 Hz比10 Hz和1 Hz的細胞趨電性都更好；把上述三者與前期研究的直流電場和脈沖電場細胞運動相比，發現5 Hz斜坡波電場下細胞導向性不亞于直流電場，且遷移速率最好，該波形電場是本研究中細胞趨電性最優的電場。

施加電場的幅值、工作頻率、波形和總體極性都能改變細胞的運動特性。本研究中正弦波、三角波和斜坡波均具有正向偏置，因此，這三種電場整個波形在任意時刻都具有非負電壓，從而在單位周期內正負電極的電荷積累均不為零，結果細胞均具有明顯的向負極移動特性，說明單位周期內電荷積累的總體極性最終決定細胞所能感受的“電方向指引”(Electrically Directional Cue)。Babonapilipos等[12]發現室管膜神經前體細胞在電中性雙極脈沖電場下發生隨機運動，而我們的前期研究[37]也發現阿米巴細胞在5 Hz和10 Hz電中性脈沖電場下運動方向隨機而遷移速率增強。我們猜測在臨床研究中，電中性變化電場促進傷口愈合的原因可能是由上述兩研究證實的電場促進細胞遷移速率增強，而非細胞導向性增加。Hart等[39]發現直流電場疊加交變電場使細胞導向性比直流電場更高，遷移速率略低，并推論變化電場影響負電荷糖萼與基質間吸附力，從而影響細胞移動性；本研究的電場設計可理解為在直流5 V/cm電場基礎上疊加幅值為±5 V/cm雙極正弦波、三角波和斜坡波，但本研究結果與該研究略有不同：發現疊加電場的細胞導向性不優于直流電場，但斜坡波遷移速率優于直流電場，這可能是由本研究設計波形的非對稱性，特別是斜坡波的上升沿與下降沿的明顯差別對細胞趨電性影響不同造成的。我們的前期研究[37]發現，10 Hz脈沖電場下細胞趨電性優于5 Hz，但本研究發現正弦波、三角波和斜坡波不支持此觀點，5 Hz電場下細胞趨電性反而比10 Hz更好，提示波形變化對細胞趨電性的影響可能大于頻率變化。本研究發現與三角波與正弦波相比，斜坡波具有更好的細胞遷移速率，可能是因為斜坡波具有更大的電壓變化率：在最高電壓10 V時，斜坡波的上升沿的電壓變化率與脈沖波接近，遠大于10 V/ms；與之相比，三角波和正弦波的電壓變化率分別為0.1 V/ms和更低，該結果與前期研究[37]中脈沖電場結果一致。本研究的主要不足是僅分析了單向正弦波、三角波、斜坡波電場下的細胞趨電性，并未分析這三種電場具有負向波形的情況，并且本研究施加電場的頻率較低，后續將在這些方面進一步改進并探索。