自噬途徑在納米材料毒性作用中的研究進展*

許蓬娟，于志超，褚曉倩，高靜，譚俊珍△

(1.天津中醫藥大學中西醫結合學院，天津 301617；2.天津中德應用技術大學科研處，天津 300350)

1 引 言

納米材料是指其結構成分至少在一個維度上小于100 nm的材料[1]，因其獨特的物理化學特性被廣泛應用。盡管納米材料有其優越性，但其對人體的毒性及與決定細胞命運的細胞機制的相互作用的認識仍極其有限。在此，我們對納米材料毒性與自噬的機制的關系及其潛在意義進行歸納總結，旨在增加對納米材料與自噬機制的相互作用的理解。

2 納米材料的毒性作用

目前，商用納米材料越來越普遍，人們可以通過各種消費品接觸到納米材料。同時，納米醫學的快速發展將納米材料廣泛應用于臨床診斷和治療，大量納米藥物被設計用于治療各種疾病，如神經系統疾病、糖尿病、癌癥、傳染病和過敏等[2]。這使人體完全暴露在納米材料的環境中，因此，納米材料的生物安全性問題引起越來越多的關注[3-4]。

納米材料一旦被人體吸收，可分布在心臟、腦實質、肝臟、骨髓等多個器官[5-6]，由于其獨特的尺寸及高表面積，尤其是表面修飾后，納米材料還可以越過多個人體生物屏障，如血-腦屏障、血-睪屏障[7-8]。研究表明，多種納米材料對人類健康存在潛在危害。

在大鼠及小鼠模型中均證實吸入或滴注納米碳黑或其他碳納米材料，可以造成過敏或肺部炎癥反應[9-11]，并會誘發大鼠肺部腫瘤[12]。Belyanskaya等[13]發現單壁碳納米管(single-walled carbon nanotubes, SWNTs)對雞胚有明顯的神經毒性作用，可以顯著減少神經膠質細胞的數目，且使細胞電生理功能降低。此外，SWNTs還可以抑制胚胎發育，甚至導致胚胎死亡[14]。Lara-Martínez等[15]則發現功能化多壁碳納米管(multi-walled carbon nanotubes, MWNTs)對雞胚也具有嚴重的毒性作用。

典型的金屬納米材料，如納米銀(Ag)、納米金(Au)、納米銅(Cu)以及各類納米氧化物等，也均被證實對細胞或機體有毒性作用。納米Ag對MCF-7細胞有毒性作用，低濃度納米Ag可誘導細胞發生壞死和凋亡，而高濃度納米Ag則會引發細胞壞死[16-17]。此外，納米Ag還可以造成人類皮膚、纖維肉瘤和睪丸癌細胞等不同實驗模型的細胞死亡[18-20]。納米氧化鋅(ZnO)對酵母、海魚胚胎及其發育均有較強的毒性作用[21-22]。納米ZnO和納米二氧化鈦(TiO2)等在各種動物模型中均被發現可在大腦沉積，并產生神經毒性[23-24]。納米TiO2對人體及環境健康都有較強的毒性作用。此外，納米Cu及納米氧化銅(CuO)對細胞及大鼠均有急性毒性效應，會造成細胞死亡及動物存活率降低等，且肝臟和腎臟是其影響最大的器官，也是其他多種納米材料毒性作用的靶器官[25-28]。

目前，美國環境保護署報告將人工納米粒子歸為具有未知毒性物質[29]。鑒于納米材料的廣泛應用及其對人體、環境潛在的危害，為保證納米科技的健康發展，對納米技術的生物安全評估十分重要，而尋求納米材料普遍的毒性機制成為當前的研究熱點。

3 自噬途徑

自噬(Autophagy)是真核細胞中的固有信號活動，可消除損傷、老化蛋白或細胞器，對維持細胞體內平衡過程發揮重要作用。正常的生理狀態下，自噬扮演細胞保衛者的角色用以抵抗意外死亡。自噬的保護作用有助于急性期細胞存活反應，而長期自噬會產生慢性損傷[30]。自噬有兩種基本類型，即選擇性和非選擇性自噬，選擇性自噬又可以根據如何轉運物質及其機制進行進一步分類，如大自噬、小自噬及分子伴侶介導的自噬。其中，大自噬是最典型的、最主要的自噬途徑。自噬一般分為四個階段：啟動階段、延伸階段、成熟階段和降解階段。首先，泛素蛋白復合物或其它細胞垃圾可以刺激自噬途徑啟動。其中，Beclin-1是自噬起始階段一種關鍵蛋白質，Beclin-1首先與磷脂酰肌醇3-激酶(the class III phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)和自噬相關(autophagy-related, Atg)蛋白14結合進而招募其他相關蛋白，因此，Beclin-1常被視為自噬啟動的標志蛋白。接下來，自噬的組裝依賴于Atg7、Atg12和Atg5等，Atg12可以被Atg7激活并結合在Atg5上，形成復合物參與自噬體的組裝。在自噬體伸展擴張期間，細胞質型的LC3-I會發生裂解，繼而結合磷脂酰乙醇胺形成自噬小體膜型的LC3-II，故研究中通常將LC3染色作為自噬標記物，將LC3-II/LC3-I比值用于評估自噬水平的高低。最后在自噬晚期，p62與LC3-II結合并作為自噬底物在溶酶體內被降解，因此，p62常被看做自噬體降解的重要指標，最后在LAMP2調節下自噬完成[31]。整個過程稱為自噬通量。

自噬受多種分子信號調節，如mTOR(雷帕霉素激酶的調節靶點)，它是自噬的主要負調節因子。而AMP依賴的蛋白激酶(5′AMP-activated protein kinase, AMPK)和PI3K則是兩種常見促進自噬的激酶。

4 自噬途徑參與納米材料的毒性作用

近幾年，隨著對自噬認識的深入，研究者們發現自噬紊亂參與了納米材料的毒性作用[32]。研究指出，大量納米材料的作用過程均有自噬參與，且納米材料的不同大小或濃度會產生不同的自噬反應[33-34]。自噬途徑在納米材料毒性機制中的表現是雙向的，一方面，部分納米材料可在細胞內積累，并通過干擾囊泡運輸和細胞骨架形成來影響自噬通量，并降低或抑制溶酶體的穩定性和酶活性，最終導致自噬受阻，納米材料誘導的自噬阻滯的結果可能是受損DNA、蛋白質和細胞器的累積[35-37]。另一方面，部分納米材料可以激活細胞自噬途徑，增加細胞自噬通量，并引導細胞死亡[34,38]。

4.1 納米金屬及金屬氧化物

Ma等[39]發現納米Au通過誘導自噬體在細胞內積累，同時阻斷p62的降解并阻斷自噬通量。Khan等[40]證實納米氧化鐵(Fe3O4)的細胞毒性也是依賴于自噬體的積累及自噬通量的異常阻斷。此外，在缺氧情況下，進入細胞的納米Au增加并誘導過度自噬聚集在巨噬細胞中，引起細胞死亡率增加，誘導巨噬細胞炎性小體活化，引起炎癥反應[41]。Eri等[42]發現納米Ag和納米鈀可通過誘導溶酶體損傷和自噬功能障礙來激活NLRP3炎癥小體造成口腔黏膜上皮細胞出現苔蘚樣病變。

多項研究證實，納米ZnO誘導細胞死亡的主要途徑之一就是自噬，如納米ZnO可誘導大鼠氣管上皮細胞發生自噬導致其細胞損傷，且其對自噬的影響比SWNTs更明顯，毒性作用更強[43]。納米TiO2可以通過激活自噬對大鼠星形膠質細胞產生毒性作用[44]。此外，納米CuO、納米氧化鋁(Al2O3)等均通過激活自噬而發揮細胞毒性作用[45]。納米鉭對小鼠成骨細胞MC3T3-E1的毒性作用也是通過激活自噬造成的[46]。

4.2 碳納米材料

碳納米材料主要由一個或多個尺寸在100 nm以下的碳組成。目前，碳納米材料包括但不限于碳量子點、納米炭黑、富勒烯、納米金剛石，以及最新的石墨烯。其中，富勒烯是碳納米顆粒中最成熟的一種，而石墨烯則被認為是具有劃時代意義的一種新材料，均是目前的研究重點與熱點[47]。

根據國際提純及化學應用聯盟(International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC)的定義，富勒烯包括C60、SWNTs和MWNTs等[48]。在細胞毒性方面，研究發現SWNTs、MWNTs、氧化石墨烯等納米材料會增加細胞內LC3-II蛋白的表達，同時p62表達也會增加，出現自噬體積累并阻止自噬通量的現象[17,43,49-50]。功能化MWNTs可以通過抑制mTOR激活自噬造成NR8383大鼠肺泡巨噬細胞存活率降低[51]。C60暴露的貽貝中，LC3B蛋白增強，溶酶體/細胞質體積比增加，最終導致對貽貝的毒性作用[52]。

氧化石墨烯納米片通過激活自噬水平，造成骨髓間充質干細胞(BMSCs)細胞存活率降低，細胞周期阻滯，且其毒性作用存在劑量依賴性[53]。氧化石墨烯納米顆粒導致的自噬體異常積累與Toll樣受體途徑(toll-like receptor, TLR)的調節密切相關[54]。

4.3 量子點

量子點(quantum dot, QD)是一種半導體納米材料，它由周期表中Ⅲ～Ⅳ或Ⅵ化學元素族的化學元素組成，其尺寸一般在1～10 nm。由于其在熒光和光學穩定性方面的優越性，QD被認為在生物醫學領域具有潛在的診斷和治療手段[55-57]。然而，QD對人體健康的潛在威脅阻礙了量子點在生命醫學科學中的廣泛應用。現有研究指出，自噬在QD造成細胞毒性中起著重要作用。

Stephan等[58]證實以硒化鎘(CdSe)和磷化銦鎵(InGaP)為核心的兩種QD可以通過誘導自噬造成豬腎近端小管細胞的毒性作用，并指出誘導自噬可能是部分納米材料的共有特性。石墨烯量子點(GQD)可以通過激活p-p38MAPK激活自噬進而促進肺癌A549細胞的死亡[59]。此外，CdSe/ZnS量子點暴露會通過提高自噬水平，進而損害精母細胞的修復，導致細胞凋亡和精子產量下降[60]。

4.4 其他納米材料

自噬功能障礙被認為是對納米材料的主要細胞毒性反應。據報道，納米二氧化硅(SiO2)通過調節CDK7-CDK4級聯誘導過度自噬導致自噬功能障礙進而引起毒性作用[61]。PAMAM聚酰胺樹枝狀大分子通過誘導自噬體積累，阻斷自噬通量殺傷細胞[62]。黑磷(black phosphorus, BP)納米片屬于二維材料家族的新成員，研究發現其可以通過抑制自噬，增強細胞炎癥反應，進而對巨噬細胞以及肝細胞造成毒性作用[63]。

5 結語

隨著材料科學的發展，新型納米材料的出現使人們越來越關注其安全性。但納米材料的毒性評價遠遠落后于材料應用的發展，其毒性作用的具體機制尚未明確，尤其需要注意納米材料體內外毒性與臨床的差異性，如何確定人們生活中接觸的納米材料的安全濃度，是當前社會的迫切需要。未來的研究應該努力解決目前細胞毒性測試中的不足，并利用這些發現去設計改進納米材料，最終使其能更為安全地應用于人們的生活。