MiR-548d-3p調節過氧化氫刺激下人圓錐角膜成纖維細胞IL-1β的表達

王思佳，宋一菲，李曉娜，侯心淏，宋 婕，楊紀忠，

賀 瑞3b，陳維毅1，姚 蔚4

(1.太原理工大學 生物醫學工程學院，太原 030024；2.韋仕敦大學 理學院，加拿大 倫敦 N6A 3K7；3.山西省眼科醫院 a.角膜病科，b.準分子激光室，太原 030002；4.山西醫科大學 口腔醫學院，太原 030001)

圓錐角膜(keratoconus，KC)是一種以角膜基質變薄、失去正常弧度而發生錐形變形為特征的眼科臨床常見的致盲疾病，在全球范圍內的患病率約為1/2 000.除遺傳因素外，揉眼、佩帶角膜接觸鏡、紫外線等環境因素在圓錐角膜疾病的發生、發展中也發揮了重要作用[1-2]。

氧化應激是指體內氧化與抗氧化作用失衡的一種狀態。正常生理條件下，細胞新陳代謝會不斷產生活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species，RNS)等，自由基的產生和消除處于動態平衡狀態。當細胞受到如紫外線、藥物等過度刺激時，體內會產生過多的自由基，超出自身清除的能力，氧化與抗氧化系統平衡失調，致使氧化應激的發生[3]。角膜是位于眼球前壁的一層透明無血管組織，基質組織更新代謝的速率較慢。由于長期暴露于體表，吸收了絕大部分進入眼睛的紫外光線，使其更容易受到自由基的破壞，引起氧化應激水平升高[4]。健康角膜中由超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶組成的酶抗氧化系統，可有效地消除氧化副產物。有研究發現，圓錐角膜抗氧化系統異常時，體外培養的圓錐角膜患者的角膜細胞、角膜組織及血清中氧化應激標志物和總氧化水平顯著增高[5-8]。前期研究發現人正常角膜和圓錐角膜細胞中超氧化物歧化酶-2、抗氧化酶血紅素氧合酶-1和NADPH氧化還原酶3種抗氧化酶的表達存在差異[9]。以上研究表明氧化應激參與了圓錐角膜的發生、發展過程。

盡管圓錐角膜一直以來被定義為非炎癥進行性的角膜病變，但越來越多的實驗研究表明圓錐角膜與炎癥密切相關。與正常角膜對照發現，圓錐角膜患者淚液和血清中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)、血管細胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、白介素(interleukin，IL)-1/-4/-5/-6/-8/-17等炎性因子表達均顯著升高[10-12]。氧化應激可引起機體中炎癥介質的過度釋放，過度或慢性炎癥刺激會引起組織蛋白酶表達增加，降解細胞外基質，破壞組織結構和微環境，使組織穩態失衡。氧化應激、炎性因子共同參與了圓錐角膜的發生、發展[13]。前期實驗對體外培養的圓錐角膜患者角膜成纖維細胞添加100 μmol/L過氧化氫處理4 h后發現，圓錐角膜成纖維細胞中炎性因子IL-1β/-6/-8、ICAM-1和基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-1/-2/-3基因表達顯著上調，其中IL-1β上調幅度最大[13]。IL-1β能誘導許多炎癥相關基因的表達，在急性炎癥中被視為一種重要的免疫成分。如PM2.5可作用于肺上皮細胞，促進ROS的釋放，直接引起上皮細胞氧化損傷，促進巨噬細胞、肺泡上皮細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎性因子的分泌；氧化應激也可刺激心肌細胞中IL-1β表達升高，從而誘發心肌炎癥反應[14-15]。但圓錐角膜中IL-1β表達調控機制尚不清楚。

微小RNA(microRNA，miRNAs)是一類由21-25個核苷酸組成的內源性非蛋白編碼單鏈RNA，作為重要的基因表達調控因子，miRNAs通過3′-UTR(untranslated region)端互補結合降解mRNA或抑制 mRNA的翻譯，在轉錄后水平對靶基因的表達進行調控。研究發現多種miRNAs在角膜組織中表達豐富，miRNAs的異常表達也在眼部疾病的發生、發展及預后中起重要作用[16-17]。此外，miRNAs參與調控機體內氧化應激水平，如在一定濃度過氧化氫誘導的人晶狀體上皮細胞氧化應激中miR-34a表達水平顯著增加，下調miR-34a表達后可增加人晶狀體上皮細胞存活率[18]；miR-506/miR-124通過靶向KLF4和KLF5抑制過氧化氫誘導的人心肌細胞中ROS表達[19]。機體內多種炎癥反應與miRNAs密切相關，實驗研究表明miRNAs可通過直接靶定或靶定其他通路調控IL-1β、IL-8、IL-6、TNF-α和ICAM-1等多種炎性因子的表達[20]。MiRNAs是否參與了圓錐角膜成纖維細胞中IL-1β的表達調控有待深入研究。

本文通過生物信息學方法預測與IL-1β靶定的MiRNAs，研究過氧化氫刺激下人圓錐角膜成纖維細胞中MiRNAs對IL-1β及下游與基質重塑相關基因的表達的影響，探討MiRNAs在圓錐角膜發生、發展中的調控作用，為圓錐角膜發病機制及診治提供新的潛在靶點。

1 實驗材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM/F-12基礎培養基(Hyclone，美國)，胰蛋白酶(Gibico，美國)，Ⅱ型膠原酶(Sigma，美國)，過氧化氫(上海碧云天)，TRIZOL及Prime-ScriptTMRT reagent Kit檢測試劑(Takara，大連)，293T細胞株(來自中國科學院細胞庫)，lip-2000轉染試劑(Invitrogen，美國)，Dual-Luciferase 報告基因檢測系統試劑盒(promega，美國)。

1.2 人圓錐角膜成纖維細胞的提取及培養

實驗所需的人圓錐角膜成纖維細胞(hKCFs)取自山西省眼科醫院角膜術后廢棄病理組織。機械剝離角膜上皮和內皮層，磷酸緩沖鹽溶液反復清洗后，用質量濃度1 mg/mL Ⅱ型膠原酶的培養基消化，直至組織塊完全消失，鏡下可見單個細胞時終止消化。2 000 r/min離心5 min，棄上清，加入適量細胞培養基，吹勻后移入培養瓶中，37 ℃、體積分數5% CO2孵箱內培養。

1.3 過氧化氫處理

采用100 μmol/L過氧化氫處理細胞12 h，以未做任何處理的細胞作為對照。處理結束后，磷酸緩沖鹽溶液清洗，用TRIZOL裂解細胞，用于RNA的提取。

1.4 IL-1β相關靶定miRNAs的預測

通過miRBase(http://www.mirbase.org/)和TargetScan(http://www.targetscan.org/)數據庫預測IL-1β相關靶定的miRNAs.對所得出的候選基因進行綜合分析，篩選出綜合得分較高的靶基因進行進一步研究。

1.5 熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測炎性因子基因和MiRNAs表達

收集細胞裂解液，分別使用反轉錄試劑盒提取mRNA，用Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit試劑盒提取MiRNA，并進行反轉錄獲得cDNA.熒光實時定量PCR按照TB GreenTMPremic Ex TaqTMⅡ說明書操作，基因表達以GAPDH為內參基因，MiRNA表達分析以U6為內參基因，采用2-ΔΔCT法對基因表達進行相對定量分析。使用引物序列見表1.

表1 人目標基因引物序列Table 1 Human target gene primer sequence

1.6 熒光素酶報告基因檢測

本實驗使用的pmirGLO雙熒光素酶報告質粒購于上海吉瑪公司，用PCR擴增包含MiR-548d-3p結合位點的野生型(WT)和含突變位點的IL-1β(MUT)片段，然后分別連接到pmirGLO載體，將pmirGLO-IL-1β WT或pmirGLO-IL-1β MUT與MiR-548d-3p及相應對照轉染到293T細胞中。48 h后棄上清，細胞用磷酸緩沖鹽溶液清洗后加入PLB裂解液裂解細胞，收樣，所得細胞用于雙熒光素酶系統檢測。使用Dual-Luciferase 報告基因檢測系統試劑盒檢測螢熒光素酶活性，螢火蟲熒光素酶活性值(LUC)與海腎熒光素酶活性值(RLUC)的比值為相對熒光素酶活性。

1.7 MiR-548d-3p mimics及inhibitor的轉染

將MiR-548d-3p mimics(模擬物)、inhibitor(抑制劑)和NC(陰性對照)miRNA以20 μmol/L濃度通過lip-2000分別轉染到hKCFs中。在37 ℃、體積分數5% CO2條件下培養6～8 h后，用含抗生素的完全培養液繼續培養48 h后收樣。

1.8 數據統計分析

實驗結果以均值±標準差表示，采用SPSS 20.0統計分析軟件中的單因素方差分析法對數據進行統計學處理，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-1β相關靶定MiRNAs的篩選

通過miRBase和TargetScan數據庫篩選出了8種與IL-1β有靶定關系的MiRNAs，即miR-21-5p，miR-24-3p，miR-26b-3p，miR-27b-5p，miR-181d-5p，miR-383-3p，MiR-548d-3p，miR-4700-3p，靶定位點如表2所示。

表2 IL-1β 3′UTR與相關MiRNAs靶定位點Table 2 Predicted MiRNAs binding sites in 3′UTR of IL-1β

2.2 過氧化氫刺激下調hKCFs中MiR-548d-3p和miR-4700-3p表達

100 μmol/L過氧化氫處理hKCFs 12 h，采用實時熒光定量PCR檢測氧化應激對細胞中miRNAs基因表達的影響(圖1).與對照組比較，過氧化氫刺激下hKCFs中miR-21-5p和miR-181a-5p的表達無顯著變化(P>0.05)；miR-27b-5p的表達顯著增加，為對照組的2.14倍(P<0.05)；miR-24-3p、miR-26b-3p、miR-383、MiR-548d-3p和miR-4700-3p的表達下降，分別減少8%、32%、33%、40%、74%(P<0.05).其中MiR-548d-3p和miR-4700-3p表達與IL-1β呈負相關且下降最為顯著。

2.3 過氧化氫刺激下hKCFs中IL-1β、MiR-548d-3p和miR-4700-3p基因表達隨時間的變化

如圖2(a)所示，與0 h對照組相比，IL-1β的表達在過氧化氫刺激6 h、12 h和 24 h后均顯著增加，分別為對照組的22倍、33倍和20倍(均P<0.05).圖2(b)結果顯示，與0 h對照組相比，MiR-548d-3p的表達在過氧化氫刺激6 h、12 h和24 h后均顯著下降，分別減少了65%、92%和94%(均P<0.05).圖2(c)結果顯示，與0 h對照組相比，miR-4700-3p的表達只在過氧化氫刺激12 h和24 h后下降，分別減少了73%和61%(P<0.05)，但下降幅度均低于MiR-548d-3p.結果顯示在hKCFs中MiR-548d-3p與IL-1β負相關性更為明顯。

2.4 MiR-548d-3p與IL-1β存在靶定關系

如圖3所示，雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，MiR-548d-3p結合IL-1β 3′UTR 轉染后熒光素酶的活性下降了21%，表明MiR-548d-3p能夠作用于IL-1β 3′UTR區域；而將IL-1β 3′UTR區域進行突變后，熒光素酶的活性較野生型增加15%(P<0.05)，與對照組相比無統計學差異(P>0.05).說明此突變位點可能為兩者結合的位點。因此，可以確定IL-1β是MiR-548d-3p的靶點，即 MiR-548d-3p參與了氧化應激條件下hKCFs中IL-1β基因表達的調控。

*表示與各自對照組比較P<0.05圖1 過氧化氫對人圓錐角膜成纖維細胞中miRNAs基因表達的影響Fig.1 Gene expression of miRNAs in hKCFs exposed to H2O2

*表示分別與0 h對照組比較P<0.05圖2 過氧化氫刺激下人圓錐角膜成纖維細胞IL-1β(a)，MiR-548d-3p(b)和miR-4700-3p(c)基因表達隨時間的變化Fig.2 Gene expression of L-1β (a), MiR-548d-3p (b) and miR-4700-3p (c) with time in hKCFs exposed to H2O2

*表示與mimics NC比較P<0.05；#表示與IL-1β MUT mimics比較P<0.05圖3 雙熒光素酶報告基因表明MiR-548d-3p與IL-1β存在靶定關系Fig.3 Luciferase reporter assays showed that IL-1β is an authentic target ofMiR-548d-3p

2.5 MiR-548d-3p通過靶向IL-1β參與了過氧化氫刺激下MMP-1、MMP-3及CollagenI α2基因的表達調控

100 μmol/L過氧化氫處理細胞 12 h后，將MiR-548d-3p轉染到細胞中，48 h后收樣。QRT-PCR結果顯示，與各自mimics NC相比，對照組和過氧化氫組中MiR-548d-3p基因表達均顯著上升，分別為各自mimics NC的6 510倍和83 453倍(均P<0.05)；與各自inhibitor NC相比，對照組和過氧化氫組中MiR-548d-3p基因表達均顯著下降，分別減少了85%和19%(均P<0.05)，如圖4(a)-(b)所示。

轉染后IL-1β基因表達結果如圖4(c)-(d)所示。與對照組中mimics NC相比，過氧化氫組中IL-1β基因表達顯著上升，增加了23%(P<0.05)；與各自 mimics NC相比，對照組和過氧化氫組中IL-1β基因表達均顯著下降，分別減少了8%和59%(均P<0.05).與對照組中inhibitor NC相比，過氧化氫組中IL-1β基因表達顯著下降，減少了17%(P<0.05)；與各自inhibitor NC相比，對照組和過氧化氫組中IL-1β基因表達均顯著上升，分別增加了15%和36%(均P<0.05).MiR-548d-3p調控了IL-1β的表達。

圖4(e)-(g)顯示，MMP-1，MMP-3的表達隨MiR-548d-3p表達的升高而降低，CollagenI-α2的表達隨MiR-548d-3p表達的升高而升高。對照組和過氧化氫組中MMP-1基因表達均顯著下降，與mimics NC相比分別減少了20%和42%(均P<0.05)；對照組和過氧化氫組中MMP-3基因表達均顯著下降，與mimics NC相比分別減少了11%和58%(均P<0.05).隨MiR-548d-3p表達升高，對照組和過氧化氫組中CollagenI-α2基因表達均顯著增加，分別增加了16%和33%(均P<0.05).

NC為negative control；圖(a)-(d)中，*表示與各自mimics NC或 inhibitor NC比較P<0.05，#表示與對照組mimics NC或inhibitor NC比較P<0.05；圖(e)-(g)中，*表示與各自mimics NC比較P<0.05，#表示與對照組mimics NC比較P<0.05圖4 過氧化氫刺激下MiR-548d-3p mimics和inhibitor對人圓錐角膜成纖維細胞MiR-548d-3p, IL-1β, MMP-1, MMP-3, Collagen I-α2基因表達的影響Fig.4 Effects of MiR-548d-3p mimics and inhibitor on the gene expression of MiR-548d-3p, IL-1β, MMP-1, MMP-3, and Collagen I-α2

3 討論

作為一種在臨床中較為常見的致盲性疾病，圓錐角膜嚴重影響了患者的正常生活。目前圓錐角膜的發病機制尚不清楚，越來越多的研究表明，圓錐角膜不單純是遺傳性疾病，紫外線照射、慢性機械性損傷引起的氧化應激等環境因素也在圓錐角膜的發病中發揮著重要作用[2]。

有數據顯示在衰老的人角膜成纖維細胞中IL-1β的表達和分泌水平明顯高于正常人角膜成纖維細胞；而對比正常人角膜和圓錐角膜患者的原代角膜基質細胞的基因表達后，同樣發現IL-1β在圓錐角膜中的表達明顯升高。作為重要的炎癥調控因子，IL-1β的異常表達是多種角膜疾病的誘因[21-22]。IL-1β參與角膜損傷后的炎癥反應和傷口愈合，研究發現IL-1β能夠抑制角膜上皮干細胞的增殖和干性并促進其分化[23]；過表達IL-1β還誘導了角膜上皮干細胞和內皮細胞的衰老和凋亡[24]。本課題組的前期研究發現氧化應激對hKCFs中炎性因子及基質重塑相關基因表達影響顯著，其中IL-1β上調幅度最大，提示IL-1β可能參與圓錐角膜疾病的發生、發展[25]。

RNA測序和多重質譜分析顯示，圓錐角膜中膠原合成和成熟途徑以及分解代謝途徑發生變化，與正常角膜相比，圓錐角膜中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白顯著減少[26-27]。Ⅰ型膠原是構成角膜基質的主要組分，在抵抗角膜變形中發揮重要作用。MMPs是一組降解膠原的酶類，在組織重塑和損傷修復中起重要作用，其表達增加可引起角膜基質降解，與圓錐角膜的發生密切相關[28]。氧化應激可通過上調多種MMPs的表達，參與皮膚損傷與動脈粥樣硬化等過程，前期研究發現氧化應激可顯著上調圓錐角膜成纖維細胞中MMP-1/-3的表達[29]。在前交叉韌帶成纖維細胞中，IL-1β的存在能促進MMP-1/-2/-3的表達[30]。本研究發現，hKCFs中IL-1β的表達MMP-1和-3趨勢一致，提示IL-1β促進了圓錐角膜MMP-1和-3的表達。

有研究發現，miRNAs在細胞生長、增殖、分化和凋亡等幾乎所有重要的生物學過程中都起著至關重要的作用，至少有30種miRNAs在角膜、晶狀體、視網膜等眼部組織中特異性表達，并與眼部疾病密切相關[31]。本研究發現，在過氧化氫刺激下，hKCFs中miR-24-3p，miR-26b-3p，miR-27b-5p，miR-383，MiR-548d-3p，miR-4700-3p等的基因表達存在差異，這些miRNAs可能與圓錐角膜發病有關。其中，MiR-548d-3p的表達在過氧化氫刺激6 h、12 h和24 h后均顯著下降，miR-548是一個超靈長類特異性miRNA基因家族，廣泛分布于幾乎所有的人類染色體上，尤其是6、8和X染色體。有研究表明造血干細胞中miR-548的過表達會抑制IL-1、IL-6和IL-8的釋放[32]。本文驗證了MiR-548d-3p與IL-1β之間存在靶定關系。在氧化應激條件下，MiR-548d-3p模擬物可顯著下調hKCFs中IL-1β、MMP-1和MMP-3表達，上調CollagenI-α2表達。提示MiR-548d-3p在圓錐角膜的氧化應激損傷介導的炎癥反應中發揮了重要作用。

綜上所述，本研究表明MiR-548d-3p可能通過靶定IL-1β進而調節氧化應激條件下hKCFs中MMP-1、MMP-3和CollagenI-α2的表達。提示當圓錐角膜處于氧化應激狀態時，可考慮針對關鍵的miRNA進行抗炎治療，降低角膜組織降解的風險，減緩或組織圓錐角膜擴張的進程。