不同溶劑提取霞日-森登中黃酮類化合物成分比較

楊 洋,史永惠,劉 博,郝繼紅,陳羽涵,丁 華*

(1. 鄂爾多斯市檢驗檢測中心,內蒙古 鄂爾多斯 017010； 2. 鄂爾多斯市蒙醫醫院,內蒙古 鄂爾多斯 017010)

霞日-森登(文冠果或文冠木)為無患子科文冠果屬植物,系落葉小喬木或灌木[1-2],莖枝、種仁均可入藥[3]。中醫理論認為文冠木味甘,微苦澀,涼、輕、動、燥,具有清熱消腫止痛之功效；蒙醫理論認為霞日-森登能燥“協日烏素”,具有抗炎活血的作用,能治療風濕性關節炎、風濕內熱、皮膚風濕病等。

已有研究表明可從霞日-森登各部位中提取出多種化合物,主要為黃酮類、甾類、恩醌類、甾體類、香豆素等[4]。霞日-森登中含有多種黃酮類成分,如沒食子兒茶素、表沒食子兒茶素、兒茶素、表兒茶素、楊梅素、二氫楊梅素、槲皮素、二氫槲皮素等[5-6]。兒茶素是黃烷醇型黃酮化合物的一種,最早從兒茶中提取出來,故被命名為兒茶素。現代醫學多使用兒茶素治療小兒消化不良、腹瀉、外用治療潰瘍、濕疹等疾病。表兒茶素是一種從天然植物提取出來的黃烷醇化合物,與兒茶素互為同分異構體。表兒茶素存在我國許多中藥復方制劑中,可作為評價藥品質量的重要指標。表沒食子兒茶素是兒茶酚同系物之一,一般研究表沒食子兒茶素酸酯,故表沒食子兒茶素的記載較少。二氫槲皮素是二氫黃酮醇類化合物之一,同時還屬于維生素p族,最早被日本學者Fukui用熱水提取法從花旗松的樹皮中提取出來[7]。

本研究以不同提取溶劑對霞日-森登進行浸提,以浸膏得率為評價指標,初步判定提取效率的高低,再用高效液相色譜質譜聯用儀(HPLC-MS)測定各提取液浸膏的成分,比較黃酮類成分的差異,考察不同提取溶劑對黃酮類成分的影響,為后續試驗奠定基礎。

1 儀器、藥材與試劑

HPLC-MS(美國安捷倫公司)、旋轉蒸發器RE 52-86A(上海亞榮生化儀器廠)、電子天平AL204-IC(METTLER TOLEDO)、數控超聲波清洗器 KQ-500DE型(昆山市超聲儀器有限公司)、索氏提取器、電動真空泵、Thermo Heraevs Multifuge X3R高速冷凍離心機(上海創萌生物科技有限公司)、溶劑過濾器(天津市津騰實驗設備有限公司)。

霞日-森登(鄂爾多斯市蒙醫醫院)、乙腈[色譜級)(阿拉丁試劑有限(上海)公司]、乙酸(分析純)(國藥集團化學試劑有限公司)、 蒸餾水(廣州屈臣氏集團有限公司)、乙酸乙酯(分析純,天津市福晨化學試劑廠)、表沒食子兒茶素、表兒茶素、二氫槲皮素、兒茶素對照品(HPLC≥98%)購于上海源葉生物科技有限公司。

2 方法與結果

2.1 不同溶劑提取浸膏的制備

將干燥的霞日-森登制成粗粉,準確稱取50g粉末,用濾紙包好后放入索氏提取器中,分別加入水、乙醇、正丁醇和乙酸乙酯,加熱回流2h后,用旋轉蒸發儀蒸發回收溶劑減壓濃縮后制成浸膏,計算浸膏率,封裝好放入4℃冰箱保存備用。

2.2 成分鑒定2.2.1 色譜條件

以安捷倫Eclipse Plus C18(2.1mm × 100mm,3.5μm)為色譜柱,柱溫20℃,流速0.3mL/min,流動相組成為A：B=乙腈-0.4%醋酸溶液,按表1進行梯度洗脫。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 質譜條件

電噴霧電離子源(ESI),源電壓4.5KV,正離子檢測,采取一級全掃描及二級全掃描方式,掃描范圍50～500m/z。分別以1μg/mL的對照品溶液摸索兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素和二氫槲皮素的質譜條件,確定離子對、分解電壓和碰撞能量(見表2)。

表2 對照品的質譜條件參數

2.2.3 對照品溶液的制備

分別精密稱取兒茶素、表兒茶素、表沒食子素、二氫槲皮素對照品適量,用水溶解稀釋,制成質量濃度皆為1μg/mL的對照品溶液。

2.2.4 供試品溶液的制備

分別精密稱取霞日-森登水提取浸膏、乙醇提取浸膏、乙酸乙酯提取浸膏、正丁醇提取浸膏適量,用水溶解并稀釋,制成質量濃度皆為1μg/mL的供試品溶液。

2.2.5 測定

采用HPLC-MS法測定不同提取溶劑作用于霞日-森登得到的浸膏中的黃酮類成分。將浸膏配制為1μg/mL,利用峰面積歸一化法計算其黃酮類各成分含量。

3 結果

3.1 浸膏提取率

如表3所示,水提取浸膏率最低,乙醇提取浸膏率最高。采用乙醇和乙酸乙酯作為提取溶劑時,霞日-森登提取浸膏得率明顯高于正丁醇和水,后續試驗以乙醇提取浸膏和乙酸乙酯提取浸膏進行成分鑒定。

表3 不同溶劑浸膏提取率

3.2 黃酮類成分鑒定

圖1顯示,乙醇提取浸膏中可分離出四種黃酮類成分：兒茶素、表沒食子兒茶素、表兒茶素和二氫槲皮素；圖3顯示,乙酸乙酯提取浸膏中可分離出三種黃酮類成分：二氫槲皮素、兒茶素和表兒茶素。如圖2、4所示：乙醇提取浸膏中表沒食子兒茶素、表兒茶素含量較高；乙酸乙酯提取浸膏中表兒茶素含量較高。表4結果表明乙酸乙酯能較好提取霞日-森登中的表兒茶素,而乙醇相對于乙酸乙酯能較好的提取霞日-森登中的表沒食子兒茶素。提示不同的提取溶劑對霞日-森登浸膏中的黃酮組分影響顯著。

圖1 乙醇提取浸膏質譜圖

圖2 乙醇提取浸膏峰面積歸一化法圖

圖3 乙酸乙酯提取浸膏質譜圖

圖4 乙酸乙酯提取浸膏峰面積歸一化法圖

表4 不同溶劑提取浸膏黃酮類成分的百分含量

4 討論

霞日-森登中含有大量的黃酮類成分,黃酮類化合物是從天然產物中獲得的具有較強抗風濕活性的物質,不同黃酮類化合物的抗風濕活性作用可能不同,所以有必要對黃酮類化合物進行進一步研究。以抗風濕活性作用成分為指標,以水、乙醇、正丁醇和乙酸乙酯為溶劑對霞日-森登進行提取獲得浸膏,用HPLC-MS法檢測浸膏的黃酮類成分,結果證明溶劑不同,得到的霞日-森登浸膏可分離出的黃酮類成分不同。霞日-森登的研究與應用還需要更多的數據支持,后期擬繼續采用響應面法優化提取霞日-森登多種成分的條件,更加細致的研究其抗風濕有效成分,深入研究其藥理藥效,以期為促進霞日-森登的臨床應用提供理論依據。