不同基原忍冬屬藥材指紋圖譜的建立

王閩予，李國衛，索彩仙，潘禮業，魏 梅，孫冬梅，何嘉瑩

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業重點實驗室，廣東 佛山 528244

《中國藥典》2015年版收載的忍冬屬LoniceraL.花類藥材共2種，分別為金銀花（基原為忍冬屬植物忍冬L.japonicaThunb.）及山銀花（灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.、紅腺忍冬L.hypoglaucaMiq、華南忍冬L.confusaDC.和黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng[1]。而川銀花則是列入《四川省中藥材標準》2010年版，為忍冬屬植物細氈毛忍冬L.similisHemsl.、淡紅忍冬L.acuminataWall.的干燥花蕾或帶初開的花，前者習稱“南江銀花”，后者習稱“肚子銀花”或“沐川銀花”[2]。忍冬始載于《名醫別錄》，后《新修本草》《證類本草》均有收錄[3]。《中國植物志》中記載了忍冬屬植物在我國有98種之多，廣泛分布于全國各省區，其中以金銀花、山銀花為主要商品在市場上流通，金銀花以山東平邑、河南封丘為主要產區；山銀花主產于湖北、云南、貴州、廣西等地區；川銀花則主產于四川。上述三者均具有清熱解毒、疏散風熱、抑菌抗菌、抗病毒的功效，主治癰腫療瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等病癥[4-5]。

由于金銀花一直作為藥食同源使用，雖然目前人工種植已成規模，但仍供不應求，加上忍冬屬植物種類繁多且形態相近、功效相似，所以藥材市場存在摻偽混淆等現象，因此，開展金銀花與同屬其它基原品種鑒別研究十分必要。目前采用HPLC指紋圖譜鑒別金銀花和山銀花的文獻較多，且鑒別多數為金銀花和山銀花[6-12]。本實驗對忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬以及淡紅忍冬4個基原共47批藥材進行研究，建立同時進行UPLC指紋圖譜與多指標含量測定方法的基礎上，結合聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘法-判別（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）分析，比較不同基原忍冬屬藥材的差異性，為忍冬屬藥材鑒別和檢驗提供數據參考。

1 儀器與材料

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Waters BEH Phenyl（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱；Mettler XP-26型百萬分之一天平，ME204E型萬分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q型超純水凈化系統（美國Millipore公司）；KQ-500DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；甲醇、乙腈為色譜純（Merk公司）；水為Mili-Q純化水；其余試劑為分析純。

綠原酸（批號110753-201817，質量分數96.8%）、馬錢苷（批號111640-201808，質量分數99%）、蘆丁（批號10080-201811，質量分數91.7%）、木犀草苷（批號111720-201609，質量分數94.9%），由中國食品藥品檢定研究院提供；異綠原酸A（批號wkq18041207）、異綠原酸B（批號wkq17060705）、異綠原酸C（批號wkq18050905）、隱綠原酸（批號wkq16081903）、新綠原酸（批號wkq16050805）、獐牙菜苷（批號wqk17092203）質量分數均為98%，由四川省維克奇生物科技有限公司提供；實驗所用藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任中藥師鑒定，JYH1～JYH12號樣品為忍冬L.japonicaThunb.，HZ1～HZ11號樣品為灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.；HH1～HH12號樣品為黃褐毛忍冬L.fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng；DH1～DH12號樣品為淡紅忍冬L.acuminataWall.。藥材具體信息見表1。

表1 藥材信息Table 1 Details of Lonicera

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Waters BEH Phenyl色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），體積流量0.3 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為240 nm；以乙腈（A）-0.1%磷酸（B）為流動相，梯度洗脫，0～1 min，4%～5% A；1～9 min，5%～6% A；9～13 min，6%～10% A；13～15 min，10%～14% A；15～30 min，14%～25% A。

2.2 對照品溶液制備

取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、綠原酸A、異綠原酸C對照品適量，精密稱定，加甲醇制成質量濃度分別為12.201、456.609、7.901、7.790、14.906、17.916、11.851、8.129、270.480、30.679 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

取樣品粉末（過四號篩）約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz）30 min，放冷，用70%甲醇補足減失質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.4 指紋圖譜方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續進樣6次，以綠原酸為參照峰，計算15個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD＜2%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，以綠原酸為參照峰，計算15個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD＜2%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取樣品粉末約0.5 g，平行6份，按“2.3”項下確定的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，以綠原酸為參照峰，計算15個共有峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD＜2%，表明方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜分析及評價

2.5.1 指紋圖譜的建立及共有峰歸屬 采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0版）”對47批藥材樣品UPLC指紋圖譜進行分析，其中忍冬的色譜峰信息最豐富，確定15個共有峰（圖1）；灰氈毛忍冬確定8個共有峰（圖2）；黃褐毛忍冬確定9個共有峰（圖3）；淡紅忍冬確定11個共有峰（圖4）。4者共有峰個數為8，其中2號峰（綠原酸）分離度好，峰形對稱，為藥材中清熱、抗菌、抗病毒的主要成分之一，故以2號綠原酸峰為參照峰（S）。通過各對照品保留時間和紫外吸收光譜對藥材中共有峰的化學成分進行歸屬，峰1為新綠原酸，峰2為綠原酸，峰4為隱綠原酸，峰7為馬錢苷，峰8為獐牙菜苷，峰10為蘆丁，峰11為木犀草苷，峰12為異綠原酸B，峰13為異綠原酸A，峰15為異綠原酸C（圖5）。

圖1 12批忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.1 UPLC fingerprints of 12 batches of L.japonica Thunb.

圖2 11批灰氈毛忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.2 UPLC fingerprints of 11 batches of L.macranthoides Hand.-Mazz.

圖3 12批黃褐毛忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.3 UPLC fingerprints of 12 batches of Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng

圖4 12批淡紅忍冬藥材UPLC指紋圖譜Fig.4 UPLC fingerprints of 12 batches of L.acuminata

圖5 共有峰歸屬UPLC圖Fig.5 Attribution graph of UPLC fingerprint common peaks

2.5.2 相似度評價結果 采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0版本）”分別對JYH1～JYH12、HZ1～HZ11、HH1～HH12、RD1～RD12共47批藥材樣品UPLC指紋圖譜進行數據處理，以峰2（綠原酸）為參照峰，采用平均數，時間窗口為1，自動匹配，計算相似度系數，12批忍冬藥材的相似度均在0.980以上，11批灰氈毛忍冬藥材的相似度均在0.986～0.999，12批黃褐毛忍冬藥材的相似度均在0.791～0.981，12批淡紅忍冬藥材相似度均為1.000，樣品相似度最高。相似度結果說明不同來源、同一基原的忍冬屬藥材化學成分具有較好的一致性，結果見表2。

表2 不同基原藥材樣品相似度評價結果Table 2 Results of similarity evalution of samples from different origins

2.5.3 不同品種藥材UPLC指紋圖譜和相似度比較通過UPLC指紋圖譜結果顯示，忍冬、灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬和淡紅忍冬藥材樣品共有峰個數分別為15、8、9及11個，四者共有峰有8個。分別將上述4個基原樣品的對照圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012.0版本）”軟件，兩兩對比，其中忍冬與灰氈毛忍冬、黃褐毛忍冬、淡紅忍冬的相似度分別為0.856、0.575、0.880；灰氈毛忍冬與黃褐毛忍冬、淡紅忍冬的相似度分別為0.800、0.979；黃褐毛忍冬與淡紅忍冬的相似度為0.723。結果表明，不同基原樣品間的指紋圖譜共有峰信息和相似度均有差異，說明即便是同屬藥材，其化學成分亦存在著差異。

2.6 聚類分類

運用SPSS軟件對47批藥材樣品進行系統聚類，采用組間平均數聯結法，以余弦距離作為樣品相似度的距離公式，樣品聚為4類（圖6）。JYH1～JYH12為忍冬聚為一類，HZ1～HZ11為灰氈毛忍冬聚為一類，HH1～HH12為黃褐毛忍冬聚為一類，DH1～DH12為淡紅忍冬聚為一類。從總體數據來看，不同品種的藥材樣品具有明顯差異。

圖6 47批藥材樣品聚類分析結果Fig.6 Cluster analysis result of 47batches of samples

2.7 樣品含量測定

基于上述研究結果，為了進一步評價4個基原忍冬屬藥材的質量，本研究對已進行歸屬的10個化學成分進行含量測定，并對結果進行多元統計分析，以區分不同基原忍冬屬藥材之間的差異。

2.7.1 線性范圍 取“2.2”項下的對照品儲備液，加甲醇稀釋制得6個不同質量濃度的對照品溶液，以峰面積為縱坐標（Y），質量濃度為橫坐標（X）進行線性回歸，各對照品的線性關系良好，結果見表3。

表3 回歸方程及線性范圍Table 3 Regression euqation and linear line

2.7.2 精密度試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下的色譜條件連續進樣6次，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件，分別于0、2、4、6、8、12 h進樣測定，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD均小于2%，表明供試品溶液穩定性良好。

2.7.4 重復性試驗 取樣品粉末約0.5 g，平行6份，按“2.3”項下確定的方法制備供試品溶液，按“2.1”項下的的色譜條件測定，計算新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C質量分數的RSD均小于2%，表明方法重復性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的忍冬藥材（JYH3）0.25 g，平行6份，加入與樣品中含量等量的對照品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進行測定，計算加樣回收率。測得新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、綠原酸A、異綠原酸C平均加樣回收率分別為94.15%、95.56%、98.19%、96.57%、98.90%、106.79%、96.40%、96.92%、98.55%、97.93%，RSD分別為2.32%、0.53%、2.57%、1.68%、1.04%、0.62%、1.84%、1.80%、1.96%、1.80%。

2.7.6 含量測定 精密稱取47批樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，得到含量測定結果，見表4。結果顯示，不同基原忍冬屬藥材的10個成分含量差異顯著。經過分析多批次樣品，發現獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷為忍冬基原的差異成分；馬錢苷在忍冬及淡紅忍冬與其他2個基原的樣品能檢出；新綠原酸為4個基原樣品的共有成分，但在灰氈毛忍冬中的含量明顯高于其他基原，質量分數均值為5.429 mg/g，淡紅忍冬次之，含量均值為2.264 mg/g，忍冬與黃褐毛忍冬中的新綠原酸質量分數較低，分別為0.707、0.613 mg/g。

2.8 多元統計分析

2.8.1 主成分分析（principal component analysis，PCA） 以10個成分含量測定結果為變量，采用SPSS 22.0軟件進行主成分分析，由表5可知，共提取了3個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻率達94.026%，表明可以用3個主成分反映不同基原忍冬屬藥材主要的質量特征。從表6可以看出，在第1主成分有較高載荷的包括馬錢苷、異綠原酸C；在第2主成分有較高載荷的包括獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷，主要為黃酮類成分；第3主成分有較高荷載的包括新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸，主要為酚酸類成分（載荷值＞0.90）。以降維得到的3個主成分得分作為X、Y、Z軸，得到47個樣品的散點分布圖，結果顯示，4種不同基原忍冬屬樣品能實現明顯區分，同基原樣品能較好的聚在同一區域，說明4種不同基原忍冬屬藥材之間的成分存在一定差異，結果見圖7。從不同樣品的3個主成分得分可以看出，忍冬基原的樣品主成分2評分均為正值，可以較好的與其他基原的樣品實現分離；淡紅忍冬基原的樣品主成分1評分均為正值，可以較好的與其他成分實現分離；而灰氈毛忍冬與黃褐毛忍冬的差異主要體現在主成分3，灰氈毛忍冬的主成分3評分均為正值，結果見表7。

表7 主成分得分Table 7 Principal component score

圖7 PCA得分分布圖Fig.7 Scatter diagram of principal component score

表5 特征根、各主成分的貢獻率Table 5 Contribution rate of characteristic roots and principal components

表6 各因子初始因子載荷矩陣Table 6 Initial factor load matrix of each factor

2.8.2 OPLS-DA 依據PCA結果，對不同基原的4組樣品進行OPLS-DA分析。OPLS-DA模型，R2X＝0.94，R2X＝0.955，Q2＝0.95，均大于0.5，說明模型穩定可靠，可用于不同基原忍冬屬樣品的區分。結果顯示，數據的分類算法中OPLS-DA的效果較好，可使4種樣本點完全被分開，相互之間沒有樣品出現交叉的情況，且全部樣品均位于95%可信區間之內，結果見圖8。采用變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）篩選造成4種基原忍冬屬樣品差異性的標志物，其中VIP值大于1的成分包括5個，分別為新綠原酸、馬錢苷、綠原酸、蘆丁、木犀草苷，這些成分是造成4種不同基原忍冬屬樣品間成分差異的主要標志性成分，其余峰VIP值小于1，對區分樣品影響較小，結果見圖9。

圖8 OPLS-DA得分圖Fig.8 Chart of OPLS-DA score

圖9 10個化學成分的VIP值Fig.9 VIP chart of 10 ingredients

3 討論

3.1 色譜條件優化

通過全波長掃描，著重考察350 nm及240 nm 2個檢測波長，通過2個檢測波長的對比，發現240 nm檢測波長所得到的色譜峰較350 nm檢測波長的色譜峰信息多，且峰形較好，故選用240 nm作為檢測波長。考察了不同色譜柱，最終確定以WatersBEH Phenyl色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）所得到的色譜圖峰形最好，峰數最多。

3.2 指紋圖譜結果分析

本研究建立了忍冬屬藥材UPLC指紋圖譜，在更短的分析時間下，分離度良好，提高了分析效率。建立的指紋圖譜基線平穩，共有峰數目多，忍冬藥材共有峰15個，灰氈毛忍冬藥材有8個，黃褐毛忍冬藥材有9個，淡紅忍冬藥材有11個，4種忍冬的共有峰有8個，通過直觀分析可以對4個基原的忍冬屬藥材進行區分。相似度評價結果顯示不同基原之間的存在一定差異，通過聚類分析可以將同基原的樣品聚為一類，說明同基原間的樣品質量穩定，具有一定的共性，同時也說明不同基原間的樣品其化學成分成分及含量均存在差異。

3.3 多指標含量測定結果分析

本研究在已建立UPLC指紋圖譜方法的基礎上，對已進行歸屬的10個化學成分進行定量分析，結果顯示不同基原忍冬屬藥材的質量存在一定差異，與指紋圖譜分析結果一致。其中，直觀結果分析顯示，金銀花化學成分最豐富，含有3個差異成分（獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷），而新綠原酸為最直觀反映4種藥材差異的共有成分，其含量大小為：灰氈毛忍冬＞淡紅忍冬＞忍冬＞黃褐毛忍冬；主成分分析降維得到3個主成分，可以將47個樣本分為基原一致的4類，其中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、獐牙菜苷、蘆丁、木犀草苷和異綠原酸C 8個成分為區別不同基原藥材的關鍵因素；OPLS-DA分析同樣將47個樣本分為3類，分類效果顯著，與聚類分析、主成分分析結果一致，OPLS-DA分析顯示區分不同基原樣品的標志性成分分別為新綠原酸、馬錢苷、綠原酸、蘆丁、木犀草苷，說明OPLS-DA分析與主成分分析的評價結果一致，進一步說明不同基原忍冬屬藥材之間存在差異的科學性。

本研究建立了同時測定忍冬屬藥材的UPLC特征圖譜及10個特征性成分含量的方法，采用聚類分析、PCA分析與OPLS-DA，對不同來源的47個不同基原的樣本進行了分析，結果顯示忍冬屬4個不同基原藥材存在一定差異，為忍冬屬藥材的質量控制提供了可靠的分析方法與參考依據。

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