不同產地及種植年限巴戟天中6種寡糖類成分的定量分析

朱露林，沈 ，易曉薇，徐金龍，劉考鏵，劉夢琴，張 奇，秦路平*，張巧艷*

1.浙江中醫藥大學藥學院，浙江 杭州 310053

2.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九六九醫院，內蒙古 呼和浩特 010051

巴戟天為茜草科（Rubiaceae）植物巴戟天Morinda officinalisHow.肉質干燥根，主產于廣東、廣西、福建、海南等地，并收載于歷版《中國藥典》。巴戟天入肝、腎經，味甘、辛，性溫；具有補肝腎、通筋活絡、強筋骨、祛風濕的功能，常用于治療陽痿遺精、宮冷不孕、月經不調、少腹冷痛、風濕痹痛和筋骨痿軟等病癥[1-2]。研究表明巴戟天主要含有多糖、寡糖、環烯醚萜苷和蒽醌等化學成分，具有溫腎壯陽、抗炎、鎮痛、抗骨質疏松、抗抑郁、免疫調節和抗氧化等多種生物活性[3-7]。巴戟天含糖量較高，包括單糖、寡糖和多糖，《中國藥典》2020年版以寡糖類成分耐斯糖的含量作為評價巴戟天藥材的質量標準[1]。研究發現寡糖類成分具有抗抑郁、抗焦慮、抗衰老、抗炎、促進精子生成和抗心肌缺血再灌注等作用[2,8-11]。目前對寡糖類成分的測定，缺少以活性寡糖類成分為評價指標研究不同產地和生長年限的巴戟天藥材中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖含量變化情況。本研究以6種寡糖為指標成分，采用HPLC-ELSD的方法進行含量測定，對不同產地及種植年限巴戟天藥材進行綜合評價，以期為巴戟天寡糖的質量控制提供參考依據。

1 儀器與試藥

Agilent 1260高校液相色譜儀（美國Agilent公司）；ELSD1290蒸發光散射檢測器（美國Agilent公司）。

蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖（蔗果四糖）、1F-果呋喃糖基耐斯糖（蔗果五糖）、蔗果六糖、蔗果七糖對照品均購于上海源葉生物科技有限公司，質量分數均大于98%；乙腈為色譜純（泰坦科技股份有限公司），水為超純水，其余均為分析純。

21批巴戟天樣品于2017年4月至2019年10月采自福建、廣東和廣西等種植地，及2批商品藥材，編號S1～S23，見表1，經浙江中醫藥大學張巧艷教授鑒定為巴戟天Morinda officinalisHow.的地下部分。

表1 巴戟天藥材來源Table 1 Sources of Morinda officinalis

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖對照品適量，初始流動相配制成質量濃度分別為0.850、0.604、0.732、0.366、0.396、0.754 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

精密稱取巴戟天粉末（過3號篩）約3 g，精密稱定，置具塞錐形中，精密加入5%乙醇50 mL，稱定質量，回流30 min，放置室溫后，5%乙醇補足質量，搖勻，濾過。

2.3 色譜條件

色譜柱為Shodex Asahipak NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測器為ELSD蒸發光散射檢測器，流動相為乙腈（A）-0.1%乙酸水溶液（B）,梯度洗脫：0～35 min，70%～67% A。體積流量1.0 mL/min；進樣量6 μL，漂移管溫度80 ℃，霧化管溫度40 ℃，平滑時間5.0 s，增益值為1.0，氮氣體積流量1.6 mL/min，柱溫28 ℃。6種寡糖對照品和樣品色譜圖見圖1，分離度均＞1.5。

圖1 巴戟天寡糖混合對照品 (A) 和供試品溶液 (B) 的HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of Morinda officinalis oligosaccharides mixed reference substances (A) and sample(B)

2.4 線性關系考察

精密量取“2.1”項下混合對照品溶液，用有機微孔濾膜（0.22 μm）濾過，分別進樣1、2、4、8、10、12、16、20、32 μL，按“2.3”項下色譜條件測定，以質量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得線性回歸方程，結果見表2。

表2 巴戟天6種寡糖類成分的線性關系Table 2 Linear relationships of oligosaccharides of Morinda officinalis

2.5 精密度試驗

精密稱取樣品（S21），按照“2.2”項下方法制備，“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積，結果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的峰面積RSD值分別為0.51%、0.06%、1.01%、0.28%、0.95%、0.09%，表明儀器的精密度良好。

2.6 重復性試驗

精密稱取樣品（S21）6份，按照“2.2”項下方法制備，“2.3”項下色譜條件測定。結果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的質量分數RSD值分別為2.94%、2.93%、1.59%、2.08%、1.16%、1.93%，表明該方法的重復性良好。

2.7 穩定性試驗

精密稱取樣品（S21），按照“2.2”項下方法制備，“2.3”項下色譜條件分別于0、2、4、8、12、24、48 h測定。結果蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的峰面積RSD值分別為1.48%、1.04%、0.89%、0.81%、0.70%、0.69%，表明樣品在48 h內穩定性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取已測定樣品（S21）約0.02 g，共6份，分別精密加入蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖對照品適量，按照“2.2”項下方法制備，“2.3”項下色譜條件測定，記錄峰面積，計算回收率。結果表明，寡糖各成分的加樣回收率良好。蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖的平均加樣回收率分別為99.22%、101.12%、98.71%、101.56%、100.37%、101.56%，RSD值分別為3.08%、0.85%、2.45%、2.56%、3.26%、3.11%。

2.9 樣品測定

精密稱取S1～S23批樣品，按照“2.2”項下方法制備，取制備的供試品溶液1 mL，按“2.3”項下色譜條件測定。進行3次平行實驗，記錄峰面積，標曲計算各成分的含量，結果見表3。結果表明，福建栽培地區采收的樣品中，隨著種植年限的增加，寡糖的含量越來越低，寡糖的質量分數在（232.53±9.48）～（342.31±43.88）mg/g，蔗果六糖以6年生南靖巴戟天含量最高，蔗果七糖以5年生龍巖巴戟天含量最高。廣東各栽培產地中寡糖含量在（111.92±6.52）～（394.68±19.14）mg/g，差異較大，其中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、蔗果五糖的含量以3年生高要巴戟天含量最高。而野生巴戟天和商品藥材中寡糖各成分的含量均很低。

表3 巴戟天藥材中6種寡糖類成分的測定結果 (±s , n=3)Table 3 Determination results of six oligosaccharides in Morinda officinalis (±s , n=3)

表3 巴戟天藥材中6種寡糖類成分的測定結果 (±s , n=3)Table 3 Determination results of six oligosaccharides in Morinda officinalis (±s , n=3)

編號 質量分數/(μg·g-1)蔗糖 蔗果三糖 耐斯糖 蔗果五糖 蔗果六糖 蔗果七糖 總含量S1 32.99±0.88 20.57±1.31 49.03±2.38 63.30±3.41 59.38±3.36 80.87±4.36 306.13±12.97 S2 35.59±4.92 29.90±5.59 56.27±10.36 71.41±12.46 70.54±4.90 79.57±7.03 342.31±43.88 S3 29.30±8.22 15.03±3.04 42.13±9.35 58.21±12.21 56.82±11.29 79.89±10.33 281.36±53.91 S4 31.03±5.94 17.83±4.18 38.32±4.70 48.85±6.06 47.26±6.64 63.52±2.94 246.80±18.50 S5 32.93±1.26 15.04±0.44 36.61±0.37 49.63±1.00 47.83±1.02 64.10±2.05 246.15±4.51 S6 35.12±8.94 11.77±1.83 36.29±0.52 46.97±1.14 43.61±3.54 64.42±5.15 238.17±18.25 S7 20.71±4.88 10.75±1.09 38.02±1.41 50.85±2.57 48.32±3.49 63.87±4.45 232.53±9.48 S8 35.25±0.77 19.91±0.69 34.79±1.49 42.81±1.16 40.61±1.83 55.25±1.46 228.61±5.77 S9 63.74±2.26 37.01±1.91 67.95±3.57 80.72±4.42 69.82±3.40 75.44±4.15 394.68±19.14 S10 23.38±0.94 10.73±0.51 23.13±1.23 30.23±1.56 31.83±1.33 46.13±2.13 165.43±6.20 S11 34.93±1.21 15.61±0.78 39.76±2.23 51.61±2.93 48.47±2.74 62.04±3.68 252.42±12.27 S12 36.05±0.57 14.47±0.48 29.83±0.93 35.98±2.01 34.02±1.08 46.55±1.04 196.89±4.36 S13 23.96±0.38 23.76±0.67 34.45±1.00 43.90±0.95 43.37±0.56 58.57±1.55 228.01±4.77 S14 39.29±1.36 21.11±0.25 40.57±0.15 52.24±0.48 50.54±0.66 66.62±0.91 270.37±1.85 S15 13.74±1.47 13.35±0.82 27.52±1.42 35.67±1.12 35.27±0.79 47.40±1.71 172.96±4.66 S16 27.96±2.36 18.26±0.99 41.49±0.69 56.88±0.94 56.43±0.83 73.58±0.65 274.60±4.96 S17 27.75±1.43 20.04±0.52 34.94±0.54 45.30±0.27 45.67±0.89 61.18±2.12 234.89±2.67 S18 42.17±2.66 29.77±2.16 11.84±0.84 9.52±0.77 7.89±0.29 10.74±0.31 111.92±6.52 S19 30.53±0.52 14.61±0.43 33.99±1.24 45.31±2.45 44.49±1.44 62.62±3.86 231.56±8.73 S20 17.64±0.26 8.07±0.19 20.59±0.63 28.75±0.59 30.46±0.92 43.97±0.87 149.47±3.40 S21 15.06±0.92 9.81±0.83 20.55±0.67 26.84±0.80 27.03±0.37 38.41±1.11 137.69±3.63 S22 11.78±0.03 8.80±0.29 15.53±0.15 19.91±0.38 22.48±0.52 35.12±1.00 113.62±1.43 S23 12.30±0.25 6.17±0.07 16.84±0.58 23.81±0.92 24.52±0.45 38.01±0.92 121.65±2.43

3 討論

藥材中次生代謝產物的形成以及含量變化是一個復雜的動態過程，與生態環境、生長年限以及物候期有著緊密的關系[12]。本研究通過采集不同產地及不同種植年限、采收時間的19批巴戟天新鮮樣品和2批野生巴戟天樣品及2批商品藥材進行含量測定研究，發現巴戟天肉質根中寡糖類成分的含量存在較大差異。

不同地區土壤、光照、降水、氣候等環境因素不同，影響寡糖類成分在肉質根的積累過程，從而導致巴戟天藥材的質量差異。巴戟天主產于福建、廣東、廣西等地，廣東種植基地較多，且分布較廣，這可能是導致寡糖類成分差異較大的原因；福建主要的種植基地漳州南靖和龍巖，種植規模均相對較小，屬于農民散戶的小面積栽培。目前，廣西已無大面積巴戟天種植基地，多數為生長在深山環境中的野生品，自然環境中降水、光照和營養物質等生長條件不穩定，導致有效成分累積緩慢、含量偏低。除此之外，人工栽培巴戟天會于春季對枝葉進行修剪以減少了水分的蒸騰及有機物的分解，使得植物長勢更好，有利于營養物質更多的積累。這可能是2批野生巴戟天藥材寡糖含量較低的原因。

同一產地不同種植年限的巴戟天寡糖類成分含量之間也存在顯著的差異。福建巴戟天樣品結果顯示，隨著種植時間增長，寡糖增加呈先增后降的趨勢，廣東巴戟天寡糖含量也有此趨勢。可能是巴戟天生長期光合作用使得單糖合成并累積，并在酶的催化作用下合成寡糖，使其含量逐漸升高；隨著生長年限的增加，植物光合作用的速率下降，如氣孔和非氣孔限制（葉片衰老），使得單糖合成減少[13]。而耐斯糖等寡糖是在蔗糖的基礎上逐漸增加一個果糖而成[14]，可能是單糖逐漸與寡糖聚合，寡糖的上單糖的數量逐漸增加，最終聚合成多糖，這可能是導致后期巴戟天寡糖含量下降的原因。根據含量測定的結果提示，福建種植的巴戟天建議在6年左右采摘，廣東種植的巴戟天建議3年左右采摘為宜。

新鮮采摘的不同產地及種植年限的巴戟天樣品，除廣東莫村6年生巴戟天外，其余樣品耐斯糖的含量均高于2%，符合藥典規定的巴戟天中耐斯糖含量不低于2%[1]。6年生莫村巴戟天耐斯糖含量低于2%，可能是由于聚合度較低的寡糖如3～5糖慢慢水解，使得耐斯糖水解脫去1分子果糖成為蔗果三糖，蔗果三糖再脫去1分子果糖成為蔗糖，進而導致蔗糖和果糖含量升高，耐斯糖的含量降低[15]。2批商品藥材中耐斯糖的含量低于2%，這可能是商品藥材在處理和儲存過程中也會導致寡糖含量的損失，與文獻[15]結果一致。

巴戟天抗抑郁的主要成分為耐斯糖，且藥典規定其耐斯糖含量不得低于2%[1]。此次研究通過測定不同產地、不同年限巴戟天中6種寡糖含量，闡明了不同產地巴戟天中寡糖含量差異及其最佳采收時間。巴戟天從種植到采收總體周期較長，而選擇在最佳采收時間采摘巴戟天可以更加充分地利用該資源，發揮更好的藥效，顯著提高巴戟天藥材的質量，對巴戟天寡糖的質量控制及其臨床應用提供保障。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突