吳茱萸HPLC指紋圖譜的建立及基原鑒別研究

戚華文，徐 鑫，高德嵩，王 引，金紅利, ，王超然, ，劉艷芳, ，梁鑫淼,

1.中國科學院大連化學物理研究所中國醫藥城生物醫藥創新研究院，江蘇 泰州 225300

2.中國科學院大連化學物理研究所, 遼寧 大連 116023

吳茱萸為常用溫里藥之一，具有散寒止痛、降逆止嘔、助陽止瀉的功效，臨床上常用于治療厥陰頭痛、寒疝腹痛、寒濕腳氣，經行腹痛等癥[1]。吳茱萸所含的化學成分類型較多，包括生物堿、檸檬苦素、萜類、黃酮等，其中生物堿和檸檬苦素類化合物是其主要活性成分。目前《中國藥典》2020年版中收錄了蕓香科植物吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吳茱萸Euodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果實作為吳茱萸的3種基原藥材[2-4]。這3種藥材在中國南部各地均有廣泛分布，是吳茱萸商品藥材中的主流品種，但吳茱萸的質量品質與不同基原的相關性還缺少充分的實驗研究，不同產地的生長環境、氣候條件可能會造成不同基原吳茱萸藥材的質量差異[5-6]。

對于吳茱萸藥材的質量控制多集中于吳茱萸堿、吳茱萸次堿和檸檬苦素的含量測定，《中國藥典》2020版中將這三者的含量作為質量評價的指標，但3種吳茱萸藥材的化學成分極為相似，僅通過個別成分的含量測定很難實現吳茱萸藥材基原的鑒別，也難以對其內在品質進行客觀評價，因此建立一種準確全面的質量控制方法尤為重要。定量指紋圖譜是目前中藥質量評價的主要方向之一，將指紋圖譜與多指標成分定量結合起來，從而實現對中藥質量的有效全面控制[7-8]。目前有關吳茱萸指紋圖譜的研究已有部分報道[9-11]，而采用HPLC定量指紋圖譜結合化學計量學分析吳茱萸基原的報道較少。

本實驗采用HPLC建立29批吳茱萸的定量指紋圖譜，并利用液質聯用技術對共用峰的化學結構進行鑒定，結合相似度評價和化學計量學方法，對不同基原的吳茱萸進行分析，為吳茱萸的質量控制及科學的臨床使用提供更多依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Alliance高效液相色譜系統，包括2695梯度泵，2998二極管陣列檢測器，自動進樣器，柱恒溫系統，Empower色譜工作站。MS204TS電子分析天平（梅特勒-托利多有限公司），島津超高效液相色譜系統，SPD-20A紫外檢測器，AB SCIEX X500系列QTOF質譜儀。

色譜柱：Tnature-ACCHROM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm, 美國沃特世公司）和Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm, 美國安捷倫公司）

1.2 試藥

對照品吳茱萸堿（批號B266，規格20 mg，質量分數99.20%）、吳茱萸次堿（批號B935，規格20 mg，質量分數99.40%）、去氫吳茱萸堿（批號5451，規格20 mg，質量分數98.0%）、水仙苷（批號4016，規格20 mg，質量分數98.0%）購自上海詩丹德標準技術服務有限公司。對照藥材吳茱萸（批號120909-201510，0.5 g/支）購自中國食品藥品檢定研究院；吳茱萸藥材共29批，采自湖南、江西省峽江縣、江西省劉公廟等地，質量符合《中國藥典》2015年版。經中國科學院大連化學物理研究所楊小平鑒定為蕓香科植物吳茱萸E.rutaecarpa(Juss.)Benth.、石虎E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis(Dode) Huang或疏毛吳茱萸E.rutaecarpa(Juss.) Benth.var.bodinieri(Dode) Huang的干燥近成熟果實。具體信息見表1。

表1 29批吳茱萸樣品信息Table 1 Samples information from 29 batches of Evodiae Fructus

乙腈（4 L，色譜級）、甲醇（4 L，色譜級）均購自Sigma-Aldrich。甲酸（500 mL，色譜級）購自Aladdin。實驗室用水來自Milli-Q超純水凈化系統（Billerica公司，美國）。

2 方法

2.1 色譜和質譜條件

2.1.1 HPLC-DAD色譜條件 色譜柱為Tnature-ACCHROM C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，美國沃特世公司），流動相乙腈（A）-0.5%甲酸溶液（B）洗脫，0～21 min，5%～27% A；21～24 min，27%～48% A；24～35 min，48%～55% A；35～50 min，55%～90% A；50～60 min，95% A；體積流量1.5 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫為30 ℃；檢測波長為252 nm。

2.1.2 HPLC-QTOF-MS質譜條件 液相條件與上述相同。離子源：ESI離子源；正離子模式；氣簾氣241 kPa；Gas 1：448 kPa；Gas 2：448 kPa；溫度620 ℃；離子化壓力5500 V，去簇電壓80 V；全掃描范圍：m/z50～1500；裂解電壓40 V。CE Spread：20 eV。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿、去氫吳茱萸堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含吳茱萸堿80 μg/mL、吳茱萸次堿80 μg/mL、去氫吳茱萸堿80 μg/mL和水仙苷80 μg/mL的混合溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 取吳茱萸藥材粉末（過3號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，稱定質量，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）60 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 精密度試驗 取同一批（S1）次吳茱萸藥材，制備供試品溶液，連續進樣6次，記錄特征圖譜。各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%，主要特征峰的相對峰面積RSD小于5%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一批（S1）次吳茱萸藥材，制備供試品溶液，分別于0、6、12、18、24 h注入液相色譜儀，記錄特征圖譜。各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%，主要特征峰的相對峰面積RSD小于5%，表明供試品溶液24 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗 取同一批（S1）次吳茱萸藥材，制備6份供試品溶液，進樣，記錄特征圖譜。各特征峰的相對保留時間RSD均小于1%，主要特征峰的相對峰面積RSD小于5%。

3 結果與分析

3.1 吳茱萸指紋圖譜的建立

取29批吳茱萸樣指紋圖譜供試品溶液，分別按“2.2.2”項制備供試品溶液，每份樣品平行2次，按“2.1.1”項的方法依次進樣檢測，獲得吳茱萸藥材的HPLC指紋圖譜（圖1）。將統一積分后的數據全部導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件》（2012版），以S1批藥材的圖譜為參照譜圖，使用中位數進行自動匹配，加以多點校正，確定13個共有色譜峰，建立吳茱萸藥材的對照譜圖（圖2）。

圖1 29批吳茱萸藥材的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 29 batches of Evodiae Fructus

圖2 吳茱萸HPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 Common pattern of HPLC fingerprints of Evodiae Fructus

3.2 特征峰的確證與指認

采用HPLC-Q-TOF-MS/MS技術，通過分析化合物的保留時間、一級離子質荷比以及二級離子碎片信息，并與相關文獻報道信息進行匹配，共鑒定出吳茱萸指紋圖譜中13個特征峰，包括4種葡萄糖酸，1種有機酸，2種黃酮類化合物、3種吲哚喹啉類生物堿和3種喹諾酮類生物堿（表2）。為進一步研究吳茱萸的化學成分組成及闡明其藥效物質基礎提供參考依據。

表2 吳茱萸指紋圖譜特征峰的鑒定Table 2 Identification of characteristic peaks of Evodiae Fructus fingerprint

3.3 指紋圖譜相似度計算

將29批吳茱萸譜圖數據導入《中藥色譜特征圖譜相似度評價系統軟件》（2012版），計算相似度，結果見表3。29批吳茱萸藥材的相似度大于0.917，不同基原的吳茱萸指紋圖譜輪廓相似，但存在一定差異。其中，吳茱萸的相似度范圍大于0.934；石虎吳茱萸相似度范圍為0.917～0.945；疏毛吳茱萸的范圍為0.920～0.952。

表3 29批吳茱萸樣品的相似度分析結果Table 3 Similarity evaluation of 29 batches of Evodiae Fructus

3.4 聚類分析

為了進一步分析不同基原吳茱萸的遠近關系，以吳茱萸指紋圖譜中13個共有峰峰面積為變量，導入SPSS 22.0軟件，采用組間均連法，選擇平方歐式距離為測度對其進行系統聚類分析，結果見圖3。由聚類結果可知29批樣品在平方歐式距離為5～10時，29批吳茱萸藥材分為3大類，不同產地不同批號的S1～S8（吳茱萸藥材）聚為一類，不同批號的S9～S24（石虎）聚為一類；S25～S29批（疏毛吳茱萸）聚為一類。由此可以看出，不同基原吳茱萸藥材具有較為明顯的分類趨勢。當平方歐式距離為10～25時，吳茱萸和石虎可以進一步聚為一類，這2種基原藥材的質量概貌更為相似。

圖3 吳茱萸藥材聚類分析樹狀圖Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 29 batches of Evodiae Fructus

3.5 正交偏最小二乘判別分析（partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）

以29批不同基原吳茱萸指紋圖譜中的13個共有峰峰面積為變量，將其導入SIMICA 14.0軟件，進行OPLS-DA。如圖4，OPLS-DA分析結果表明，吳茱萸3個基原品種樣本群處于不同的空間聚落，可以實現較好地區分，說明3種基原吳茱萸的化學成分存在一定的差異。其中，石虎吳茱萸聚落更為集中緊湊，說明同一產地的石虎吳茱萸藥材質量差異較??；相反，吳茱萸聚落較為分散，離散度大于疏毛吳茱萸樣本，可能是由于不同產地的生長環境、氣候條件造成吳茱萸藥材質量差異較大。為了進一步確認對藥材分組貢獻較大的成分，將3種基原吳茱萸藥材進行兩兩分組，根據變量重要性投影值（variable importance in project，VIP）篩選不同基原吳茱萸藥材之間的差異性質量標志物[12-14]，結果顯示，吳茱萸和石虎吳茱萸的差異性質量標志物為峰8、11、12、10；石虎吳茱萸和疏毛吳茱萸的差異性質量標志物為峰6、3、8、10、2、11；吳茱萸和疏毛吳茱萸的差異性質量標志物為峰6、3、2。

圖4 OPLS-DA分析Fig.4 OPLS-DA

3.6 含量測定

3.6.1 線性關系考察 精密吸取吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷對照品儲備液適量，配制成7個質量濃度系列的混合對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，以各對照品質量濃度（X）為橫坐標，峰面積（Y）為縱坐標，繪制標準曲線，得線性回歸方程、相關系數（R2）和線性范圍，結果見表4。

表4 4個指標成分線性關系和線性方程Table 4 Linear relationship and linear range of four components

3.6.2 精密度試驗 取混合對照品溶液，按照“2.1.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷峰面積，并計算峰面積RSD，結果顯示吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的峰面積RSD值分別為0.21%、0.08%、0.29%、0.31%，表明儀器精密度良好。

3.6.3 穩定性試驗 取同一供試品溶液（批號S1），在制備后的0、6、12、18、24 h分別進樣，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的峰面積，計算各指標成分峰面積RSD為0.58%、0.01%、0.78%、1.20%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

3.6.4 重復性試驗 取同一吳茱萸樣品粉末6份（S1），按照“2.2.2”項下樣品處理方法制備，按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，記錄吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的峰面積，計算峰面積RSD分別為1.98%、1.40%、1.82%、1.92%，表明本方法重復性較好。

3.6.5 加樣回收率試驗 精密稱取吳茱萸粉末（批號S1）6份，每份0.05 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，分別加入吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷對照品1.6、0.45、0.33、0.33 mg，精密加入75%甲醇適量，定容至25 mL量瓶，后續處理同“2.2.2”項。按照“2.1.1”項下色譜條件進行測定，結果顯示，吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷的回收率分別為96.94%、92.52%、91.79%、97.76%，RSD分別為3.19%、3.04%、4.28%、3.09%。

3.6.6 樣品含量測定 通過對29批吳茱萸藥材進行分析，測定不同基原吳茱萸藥材中吳茱萸堿、吳茱萸次堿、去氫吳茱萸堿和水仙苷含量，含量測定結果見表5。結果顯示，29批吳茱萸藥材中吳茱萸堿質量分數在1.10%～4.51%，吳茱萸次堿質量分數在0.21%～0.99%，去氫吳茱萸堿質量分數在0.60%～0.91%，水仙苷質量分數在0.14%～0.65%。

表5 吳茱萸中4種成分定量結果Table 5 Quantitative result of four components in Evodiae Fructus

4 討論

4.1 柱溫的選擇

在相同色譜柱上，比較30、35、40、45、50 ℃5個柱溫條件對同一吳茱萸樣品的分離效果。結果表明，在柱溫30 ℃條件下，特征圖譜的整體分離效果最佳。隨著柱溫升高，20 min左右主要色譜峰的分離度不斷減小，因此，選定吳茱萸藥材特征圖譜的柱溫為30 ℃。

4.2 體積流量的選擇

在1 mL/min條件下，吳茱萸藥材特征圖譜的分析時間較長（80 min），考慮到減小特征圖譜分析時間，提高檢測效率，考察1.5 mL/min條件下特征圖譜的分離效果。結果表明，在1.5 mL/min條件下，分析時間縮短至60 min，且色譜峰的數目和分離度基本相同。因此，選定吳茱萸藥材特征圖譜的體積流量為1.5 mL/min。

吳茱萸具有散寒止痛、助陽止瀉的功效，在治療和預防心血管疾病、抗菌消炎、抗過敏、抗腫瘤收縮血管等方面有顯著療效，其活性成分主要包括生物堿、黃酮、有機酸等[2]。因此，比較甲醇、75%甲醇、50%甲醇、70%乙醇對吳茱萸藥材的提取效果。從峰的數目和峰面積等方面綜合比較色譜圖發現，75%甲醇作為提取溶劑得到的樣品，其色譜峰數較多，峰面積相對較高，基線平穩，較好地反映吳茱萸藥材的質量概貌。綜合考慮，選定75%甲醇作為吳茱萸藥材特征圖譜的提取溶劑。

在相同色譜條件下，比較Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）和Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等2種色譜柱對同一吳茱萸樣品的分離效果。結果表明，吳茱萸樣品在兩根不同品牌C18色譜柱上的分離效果差別較大，其中在Tnature C18色譜柱上的峰形和分離度相對較好。這主要是由于吳茱萸樣品中含有吳茱萸堿和吳茱萸次堿等生物堿類化合物，而Tnature C18色譜柱表面帶有一定量的正電荷，有利于生物堿類化合物的分離。綜合考慮，選定吳茱萸藥材特征圖譜的分析色譜柱為Tnature C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。

本實驗對收集的29批不同基原吳茱萸藥材進行了研究，建立了3種基原吳茱萸藥材的定量指紋圖譜，標定了13個共有峰，并通過液質聯用進行峰指認，明確了吳茱萸藥材的物質基礎。在指紋圖譜的基礎上，通過聚類分析和正交偏最小二乘判別分析對3種基原吳茱萸進行了區分。結果顯示：兩種方法的分類效果均較為明顯；OPLS-DA結果中，不同基原吳茱萸藥材之間的差異性質量標志物也存在差異。此外，對吳茱萸藥材中4種指標性成分同時進行測定。由定量結果可知，3種基原吳茱萸藥材中，去氫吳茱萸堿的含量較為接近；石虎吳茱萸中吳茱萸堿、吳茱萸次堿和水仙苷的含量最高，其次是吳茱萸藥材，疏毛吳茱萸最低。由此看出，吳茱萸各化學成分的含量與基原品種密切相關，不同基原的吳茱萸藥材質量具有明顯差異。本實驗建立的吳茱萸定量指紋圖譜簡單可靠，可為吳茱萸藥材質量的綜合評價提供一定的參考依據。

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