指紋圖譜及多成分定量結合化學模式識別法評價不同產地消瘤藤質量

黃建猷 ，胡筱希，麥琬婷，黃周鋒 ，章 波，陸國壽 *，葉 勇*

1.廣西壯族自治區中醫藥研究院，廣西 南寧 530022

2.廣西中藥質量標準研究重點實驗室，廣西 南寧 530022

3.廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021

消瘤藤是虎耳草科冠蓋藤屬植物星毛冠蓋藤Pileostegia tomentellaHand.-Mazz的藤莖，主要分布于浙江、江西、福建、湖南、廣東、廣西、貴州等地[1]。廣西民間瑤醫多年的臨床實踐證明，消瘤藤具有抗腫瘤作用，可用于治療多種惡性腫瘤；同時也是廣西金秀瑤族自治縣瑤醫醫院腫瘤科用于治療各種腫瘤的主藥[2-3]，消瘤藤主要含有香豆素類、環烯醚萜苷類和苯丙素類等化學成分[3-6]，具有祛風除濕、散瘀止痛、消腫解毒的功效，現代藥理研究顯示，其不同提取部位及總香豆素等具有抗腫瘤作用[7-10]。目前已有文獻報道消瘤藤藥材質量研究，但依然存在質量控制指標簡單等問題，無法系統地評價不同產地消瘤藤藥材質量的差異性[11-12]。鑒于此，本研究首先建立了消瘤藤藥材的HPLC指紋圖譜，并以多波長同時測定其中茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當藥苷的含量，通過SPSS 22.0統計軟件和Origin Pro軟件對其進行主成分分析及聚類分析，對不同產地消瘤藤藥材質量進行綜合評價，為評價該藥材質量提供參考依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters高效液相色譜儀（2998 PDA Detector，Waters e2695 Separations Module，Empower 3色譜工作站，美國Waters公司）；XS-205型電子天平（瑞士梅特勒公司）；KS-3200DE液晶超聲波清洗器（昆山潔力美超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

7-羥基-8-甲氧基香豆素（上海源葉生物科技有限公司，批號X14O10L100104，質量分數≥98.5%）；茵芋苷（四川省維克奇生物科技有限公司，批號wkq19011409，質量分數≥98%）；7-羥基香豆素（上海源葉生物科技有限公司，批號A04A6L1，質量分數≥98%）；當藥苷（中國食品藥品檢定研究院，批號111742-200501，質量分數≥98%）；紫丁香苷（中國食品藥品檢定研究院，批號111574-201605，質量分數≥98%）。磷酸（廣東光華科技股份有限公司，分析純），乙醇（廣東光華科技股份有限公司，分析純），乙腈（默克股份兩合公司，色譜純），Milli-Q超純水系統（美國Milipore公司）。

1.3 藥材

消瘤藤分別采集于廣西不同地點，具體見表1。經廣西中醫藥研究院黃云峰副研究員鑒定為冠蓋藤屬植物星毛冠蓋藤P.tomentellaHand.- Mazz.的藤莖。

表1 消瘤藤藥材信息Table 1 Information table of 14 batches of Pileostegia tomentella Hand.

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取消瘤藤粉末（過40目篩）約0.5 g，精密稱定。置具塞三角瓶中，精密加入80%乙醇25 mL，稱定質量，超聲處理60 min，放至室溫，用80%乙醇補足減失的質量、搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2.2 混合對照品溶液的制備

取茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當藥苷對照品，精密稱定，加甲醇制成茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當藥苷質量濃度分別為234.80、68.48、3.27、24.31、38.17 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～45 min，95%～60% A；45～46 min，60%～95% A；46～60 min，95% A；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長265 nm；進樣體積10 μL。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗 取同一批消瘤藤粉末（S1）約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖，以6號峰（茵芋苷）為參照峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積，結果顯示各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于2%。

2.4.2 穩定性試驗 取同一批消瘤藤粉末（S1）約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件，分別在0、2、4、8、12、24 h測定，記錄色譜圖，以6號峰（茵芋苷）為參照峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3%，表明供試品溶液在室溫放置24 h內穩定性良好。

2.4.3 重復性試驗 取同一批消瘤藤粉末（S1）約0.5 g，精密稱定，一式6份，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄色譜圖，以6號峰（茵芋苷）為參照峰計算各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果顯示各色譜峰的相對保留時間及相對峰面積的RSD值均小于3%，表明該方法重復性良好。

2.5 指紋圖譜的建立

2.5.1 共有峰的標定 取14批不同產地消瘤藤粉末，分別按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進行測定，獲取14批消瘤藤指紋圖譜。將14批不同樣品的色譜圖導入由國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”，以S1為參照指紋圖譜，采用多點校正后進行自動匹配，選擇中位數法生成對照指紋圖譜，選擇消瘤藤中的主要成分且分離較好的色譜峰作為共有峰。

經“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”得到14批消瘤藤指紋圖譜（圖1）和對照指紋圖譜（圖2），且共標定了12個共有峰，12個共有峰總面積占總峰面積的90%以上，因此確定12個色譜峰為消瘤藤指紋圖譜的共有峰。

圖1 14批消瘤藤HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints of 14 batches of Pileostegia tomentella

圖2 消瘤藤對照指紋圖譜Fig.2 Comparison fingerprint of Pileostegia tomentella

2.5.2 相似度 將得到的14批消瘤藤指紋圖譜導入國家藥典委員會頒布的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2004A版）”，進行色譜峰匹配，生成消瘤藤對照指紋圖譜，并計算不同批次之間的相似度。14批樣品與對照圖譜之間的相似度分別為0.944、0.937、0.965、0.899、0.959、0.965、0.965、0.942、0.967、0.901、0.875、0.975、0.905、0.955。除全州龍水鎮、藤縣2個產地的藥材外，其余產地的消瘤藤藥材相似度均大于0.9，說明這些產地消瘤藤藥材質量差異較小；而全州縣龍水鎮和廣西藤縣的消瘤藤藥材相似度均接近0.9，說明這2個產地的消瘤藤雖然具有一定相似性，但質量差異較大。

2.5.3 主要色譜峰的化學指認 采用對照品對各峰進行指認，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，記錄HPLC色譜圖，通過比較各峰保留時間和紫外吸收光譜，對各峰進行指認。消瘤藤樣品HPLC指紋圖譜中茵芋苷（6號峰）、紫丁香苷（7號峰）、當藥苷（10號峰）、7-羥基香豆素（11號峰）、7-羥基-8-甲氧基香豆素（12號峰）得到了化學指認。

2.6 HPLC同時測定消瘤藤中5種有效成分的含量

2.6.1 色譜條件 色譜柱為Waters XBridge?C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%磷酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～50 min，95%～70% A；體積流量1 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長246、265、320 nm；進樣體積10 μL。茵芋苷、7-羥基香豆素、紫丁香苷、7-羥基-8-甲氧基香豆素和當藥苷5個成分按此色譜條件進行分析，理論塔板數均不低于3000，分離度均大于1.5，各成分測定不受它成分干擾。對照品和供試品的色譜圖見圖3。

圖3 混合對照品溶液 (A) 和消瘤藤供試品溶液 (B) HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of mixed reference solution (A) and pileostegia tomentella test solution (B)

2.6.2 線性關系考察 精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液1、2、4、6、8、10 mL，分別置于10 mL量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得系列混合對照品溶液。按“2.3”項下的色譜條件下分別進樣，記錄峰面積。以峰面積為縱坐標（Y），進樣質量為橫坐標（X），進行線性回歸，即得回歸方程及線性范圍。回歸方程、線性范圍及相關系數分別為：茵芋苷Y=2 019 280.3X－8 147.4，線性范圍0.234 8～2.348 0 μg，r=0.999 8；紫丁香苷Y=2 928 157.5X－491.2，線性范圍0.00 327～0.03 27 μg，r=0.999 6；當藥苷Y=2 189 650.3X－6 371.9，線性范圍0.038 17～0.381 7 μg，r=0.999 7；7-羥基香豆素Y=4 140 844.6X－6 992.5，線性范圍0.068 48～0.684 8 μg，r=0.999 8；7-羥基-8-甲氧基香豆素Y=4 979 120.6X－2 767.7，線性范圍0.024 31～0.243 1 μg，r=0.999 9；結果表明5種成分在上述質量范圍內線性關系良好。

2.6.3 精密度試驗 取同一混合對照品溶液在“2.6.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜峰面積。茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素峰面積的RSD分別為0.48%、0.83%、0.68%、0.29%和0.52%，表明儀器精密度良好。

2.6.4 穩定性試驗 取消瘤藤藥材（S1）粉末1份，約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，室溫下放置，分別在0、2、4、8、12、24 h后按“2.6.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素峰面積的RSD分別為0.80%、1.35%、1.03%、0.87%和0.96%，表明供試品溶液放置24 h內穩定性良好。

2.6.5 重復性試驗 取同一批消瘤藤藥材（S1）粉末6份，每份約0.5 g，精密稱定，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件進樣分析，記錄色譜峰面積。茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素質量分數的RSD分別為1.48%、2.01%、1.97%、1.88%和1.39%，表明該方法重復性良好。

2.6.6 加樣回收率試驗 取同一批消瘤藤藥材（S1）粉末6份，每份0.25 g，精密稱定，加入混合對照品適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，計算回收率。茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素的平均加樣回收率分別為99.85%、97.62%、98.98%、98.87%和99.01%，RSD值分別為1.77%、2.63%、2.57%、2.55%和2.38%。

2.6.7 樣品測定 取不同產地消瘤藤藥材粉末，按“2.1”項下方法平行制備供試品溶液各2份，按“2.6.1”項下色譜條件測定，記錄色譜峰面積，計算樣品中茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5個成分的量。結果見表2。

表2 樣品含量測定結果 (n＝2)Table 2 Results of contents determination of samples (n＝2)

2.7 化學模式識別

2.7.1 聚類分析 采用Origin Pro軟件通過平均聚類方法對14批藥材樣品采用分層聚類分析。這14批藥材可以分為3類，第1類為S1、S2；第2類為S7、S10、S12、S14；第3類為S3、S4、S8、S9、S2、S5、S6、S11、S13。聚類圖見圖4。

圖4 聚類熱圖Fig.4 Cluster analysis tree diagram

2.7.2 主成分分析 為了進一步比較不同產地批次間消瘤藤樣品的質量差異，將消瘤藤中的茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5個成分的含量作為變量導入到SPSS 22.0統計軟件中進行主成分分析。選取其中特征值大于1的前2個因子作為主成分1（PC1）與主成分2（PC2），貢獻率分別為62.692%和21.441%，對總方差的累積貢獻率達84.136%（表3），故PC1和PC2 2個主成分可反映消瘤藤藥材的整體綜合質量。

表3 特征值和累積貢獻率Table 3 Eigenvalue and cumulative contribution

由表4因子載荷矩陣可知，PC1與茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5個成分均呈正相關；PC2與紫丁香苷和7-羥基-8-甲氧基香豆素呈正相關。根據公式F＝Zx×t計算各主成分值，其中Zx原始數據標準化得標準化矩陣，t為標準化的正交特征向量矩陣。根據各主成分的貢獻率，計算出綜合得分，其公式為F＝0.626 95×F1＋0.214 41×F2，分別以PC1與PC2建立坐標系，得到主成分分析散點平圖（圖5），各主成分值及綜合排序結果見表5。

表4 因子載荷矩陣Table 4 Load matrix of factors

表5 主成分值及綜合主成分值Table 5 Principal component values and comprehensive principal component values

由圖5可看出，PC1和PC2可將樣品分為3類，第1類為S1、S2；第2類為S7、S10、S12、S14；第3類為S3、S4、S8、S9、S2、S5、S6、S11、S13。主成分分析與聚類分析結果相一致，進一步證明了PC1和PC2可代表消瘤藤的質量用于產地劃分。主成分分析得到的綜合主成分值，根據得分情況反映各產地消瘤藤的質量情況，質量越好，綜合得分越高。本研究中S12、S1、S14質量相對較優。

圖5 主成分分析散點圖Fig.5 Scatter plots of principal component analysis

4 討論

消瘤藤是傳統瑤醫藥治療癌癥的主要藥材之一，已被列入《廣西壯族自治區瑤藥材質量標準（第二卷）》擬收錄品種。由于地區的差異，可能導致消瘤藤品質上的不同，進而可能影響其藥效。本研究通過對廣西不同產地的14批消瘤藤藥材進行指紋圖譜研究，結果發現14批次間樣品相似度較好，質量相對較穩定。后續又測定了茵芋苷、紫丁香苷、當藥苷、7-羥基香豆素和7-羥基-8-甲氧基香豆素5種有效成分的含量，結果發現不同產地間含量存在較大差異。通過聚類分析和主成分分析等化學模式識別法[13-14]對其進行全面綜合的質量評價，結果表明S1、S12、S14等產地的消瘤藤質量較好。

文獻報道[15]，香豆素類化合物具有抗病毒、抗腫瘤、抗心律失常、抗炎鎮痛及抗菌等多種藥理活性，具有潛在的藥用價值，其中抗腫瘤作用是一個研究熱點；環烯醚萜類化合物在抗腫瘤、抗炎、降血糖、保肝活性等方面受到學者廣泛關注[16]；紫丁香苷具有具有一定的體內外抗腫瘤活性[17]。結合主成分分析綜合得分及5個成分含量測定結果可知，綜合得分排在前3的S1、S12、S14其5個成分的含量也非常靠前，綜合得分排在倒數前3的S9、S6、S5其5個成分的含量也非常靠后。綜合得分與5個成分的含量是怎樣一個關系，還有待進一步的研究。

中藥質量控制研究一直是中藥研究與發展的關鍵[18]，在中藥現代化的研究進程中，指紋圖譜技術是當今國際公認的控制中藥質量的質控模式。本研究建立指紋圖譜與含量測定相結合，應用化學模式識別法可全面評價消瘤藤質量。該法的建立為消瘤藤的質量控制及評價提供依據。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突