竹節(jié)參總皂苷對妊娠期高血壓胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應激損傷與過度自噬的影響

關 琦，張化蓮*，張珊珊，秦紅娟

1.駐馬店市中心醫(yī)院 產(chǎn)科，河南 駐馬店 463000

2.河南省人民醫(yī)院 婦產(chǎn)科，河南 鄭州 450000

妊娠期高血壓疾病（hypertension disorder complicating pregnancy，HDCP）是孕婦常見疾病之一，其發(fā)生與先兆子癇、剖宮產(chǎn)、腦血管疾病、胎兒生長受限、早產(chǎn)以及孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡等密切相關[1-2]。HDCP使妊娠復雜化，嚴重危及母嬰安全[3]。HDCP病因和發(fā)病機制復雜，越來越多的研究表明，HDCP與多種因素引起的母胎代謝或免疫平衡有關，而胎盤滋養(yǎng)細胞作為妊娠建立和維持的基礎，其功能異常后會導致胎盤形成受阻，釋放大量炎性因子，使血管內(nèi)皮受損，最終導致子癇前期的發(fā)生[4-5]。

竹節(jié)參Panax japonicus(T.Nees) C.A.Mey.是五加科人參屬植物，竹節(jié)參總皂苷是其主要有效成分，具有鎮(zhèn)痛、抗衰老、抗氧化、抗炎、免疫調(diào)節(jié)以及神經(jīng)保護效應等作用[6-7]。竹節(jié)參總皂苷對Triton WR-1339誘導的高脂血癥小鼠具有一定的調(diào)血脂作用[8]，而竹節(jié)參總皂苷在HDCP中的作用至今卻未見報道。人胎盤滋養(yǎng)細胞株HTR-8/SVneo是一種永生化的滋養(yǎng)層細胞系，具有許多與人類原代滋養(yǎng)層細胞相似的特性，目前已成為研究胎盤功能和妊娠相關疾病的主要細胞系。本研究采用亞硝基左旋精氨酸甲酯（N-nitro-L-arginine methylester，L-NAME）干預HTR-8/SVneo細胞模擬HDCP微環(huán)境，探討竹節(jié)參總皂苷對HDCP胎盤滋養(yǎng)細胞氧化應激損傷及自噬的影響，并初步探究其作用機制，從而為HDCP的研究及診治提供實驗基礎。公司；CCK-8試劑盒（批號42022ES34）和Annexin V-FITC/碘化丙啶（PI）細胞凋亡檢測試劑盒（批號40302ES20）購自北京全式金生物科技公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（批號A00312）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）檢測試劑盒（批號A00132）、谷胱甘肽（glutataione，GSH）檢測試劑盒（批號A00512）購自南京建成生物工程研究所；TRIzol試劑盒（批號15596-026）、SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑盒（批號RR047A）購自日本Takara公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號050720190702）購自上海生工生物工程有限公司；細胞裂解液（批號P0013）、BCA蛋白定量試劑盒（批號P0010S）、PVDF膜（批號P0016S）購自上海碧云天生物技術有限公司；脂肪酸結合蛋白4（fatty acid binding protein 4，F(xiàn)ABP4）抗體（批號3579S）、微管相關蛋白1輕鏈3-II（microtubule associated protein 1 light chain 3 II，LC3-II）抗體（批號3868S）、LC3-I抗體（批號4599S）、p62抗體（批號3534S）、自噬效應蛋白（Beclin-1）抗體（批號3495S）購自美國CST公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號TA-1203）、HRP標記的山羊抗兔抗體（批號ZB-2306）購自北京中杉金橋生物有限公司。

1.3 儀器

1 材料

1.1 細胞

HTR-8/SV-neo細胞購自上海瑞鹿生物技術有限公司。

1.2 藥品與試劑

竹節(jié)參總皂苷（質(zhì)量分數(shù)為85.4%）由首都醫(yī)科大學中醫(yī)藥學院中藥化學實驗室提供；L-NAME（批號1115878）購自美國Sigma公司；胎牛血清（批號2166446）、青霉素-鏈霉素（批號20190909）購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基（批號C11995500CP）購自美國Thermo Fisher Scientific

BC-J160S細胞培養(yǎng)箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；低溫高速離心機（德國Heraeus公司）；MACSQuant Analyzer流式細胞儀（德國Miltenyi公司）；光學顯微鏡（日本Olympus公司）；DYY-6C電泳儀（北京六一儀器廠）；PCR擴增儀（美國ABI公司）；M340651酶標儀（北京中西遠大科技有限公司）。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)

HTR-8/SV-neo細胞用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 μg/mL）的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2天換液1次，待細胞融合度達到80%～90%時進行傳代，使用第3～5代細胞進行后續(xù)實驗。

2.2 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞活力的影響

取處于對數(shù)生長期的HTR-8/SV-neo細胞，以4×104/mL接種至96孔板，培養(yǎng)12 h。設置對照組、模型組和竹節(jié)參總皂苷（20、40、80 μg/mL）[9]組，模型組和各給藥組加入L-NAME（100 μmol/L）處理48 h；各給藥組再加入相應藥物，對照組加入不含藥物的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，加入10 μL CCK-8試劑，孵育1 h，采用酶標儀測定450 nm處的吸光度（A）值。

2.3 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞凋亡的影響

按“2.2”項下方法處理細胞和分組，收集細胞，以PBS洗滌2次，加入500 μL 1×Binding Buffer重懸，加入5 μL Annexin V-FITC和PI試劑，室溫避光孵育15 min，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況。

2.4 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響

按“2.2”項下方法處理細胞和分組，收集上清液，按試劑盒說明書檢測細胞上清液中MDA、SOD和GSH水平。

2.5 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞FABP4、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62和Beclin-1蛋白表達的影響

按“2.2”項下方法處理細胞和分組，收集細胞，加入裂解液，10 000×g離心20 min，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶于室溫封閉2 h，分別加入FABP4、LC3-II、LC3-I、p62、Beclin-1和GAPDH抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌后，加入HRP標記的山羊抗兔抗體（1∶5000），室溫孵育2 h，加入ECL化學發(fā)光液，采用凝膠成像儀曝光成像，BandScan5.0軟件分析條帶灰度值。

2.6 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞FABP4 mRNA表達的影響

按“2.2”項下方法處理細胞和分組，收集細胞，按照試劑盒說明書提取細胞總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列：FABP4上游引物5’-AAGAGAAAACGAGAGGATGATAAAC-3’，下游 引 物5’-ATGCGAACTTCAGTCCAGGTC-3’；GAPDH上游引物5’-AGGGGTCTACATGGCAACTG-3’，下 游 引 物5’-CGACCACTTTGTCAAGCTCA-3’。

2.7 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞LC3表達影響

取處于對數(shù)生長期的HTR-8/SV-neo細胞，以1×104/孔接種至24孔板內(nèi)的無菌玻片上，培養(yǎng)12 h。按“2.2”項下方法分組，收集細胞，PBS洗滌，于4%多聚甲醛中室溫固定20 min，加入0.5%TritonX-100透膜15 min，加入10%山羊血清室溫封閉2 h，加入LC3抗體（1∶150），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌，滴加Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG抗體，室溫避光孵育1 h；PBS洗滌，滴加DAPI染色10 min；PBS洗滌，封片，于熒光顯微鏡下觀察細胞LC3表達情況。

2.8 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

3 結果

3.1 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞活力的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組細胞活力顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組細胞活力顯著升高（P＜0.05）。

圖1 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞活力的影響(±s , n=3)Fig.1 Effect of total saponins from P.japonicus on viability of HTR-8/SV-neo cells (±s , n=3)

3.2 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞凋亡的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）。

圖2 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞凋亡的影響 (±s , n=3)Fig.2 Effect of total saponins from P.japonicus on apoptosis of HTR-8/SV-neo cells (±s , n=3)

3.3 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組細胞上清液中SOD和GSH水平顯著降低（P＜0.01），MDA水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各給藥組細胞上清液中SOD和GSH水平顯著升高（P＜0.01），MDA水平顯著降低（P＜0.01）。

表1 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響 (±s , n=3)Table 1 Effect of total saponins from P.japonicus on levels of MDA, SOD and GSH in supernatant of HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

表1 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞上清液中MDA、SOD和GSH的影響 (±s , n=3)Table 1 Effect of total saponins from P.japonicus on levels of MDA, SOD and GSH in supernatant of HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01**P ＜ 0.01 vs control group; ##P ＜ 0.01 vs model group

組別 劑量/(μg·mL-1) MDA/(μmol·L-1) SOD/(μmol·L-1) GSH/(μmol·L-1)對照 — 6.56±0.62 104.01±9.77 112.81±10.21模型 — 25.87±2.31** 54.01±5.51** 64.13±6.76**竹節(jié)參總皂苷 20 17.06±2.01## 69.81±6.49## 72.84±7.62##40 12.21±1.45## 78.60±7.33## 90.61±8.81##80 10.53±0.91## 80.41±7.92## 96.89±9.07##

3.4 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞FABP4 mRNA和蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組細胞FABP4mRNA和蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組細胞FABP4mRNA和蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05）。

圖3 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞FABP4 mRNA (A) 和蛋白 (B) 表達的影響 (±s , n=3)Fig.3 Effect of total saponins from P.japonicus on expressions of FABP4 mRNA (A) and protein (B) in HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

3.5 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1蛋白表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組細胞LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平均顯著升高（P＜0.05），p62蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組LC3-Ⅱ和Beclin-1蛋白表達水平均顯著降低（P＜0.05），竹節(jié)參總皂苷（40、80 μg/mL）組p62蛋白表達水平顯著升高（P＜0.05）。

圖4 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62和Beclin-1蛋白表達的影響 (±s , n=3)Fig.4 Effect of total saponins from P.japonicus on expressions of LC3-Ⅰ, LC3-Ⅱ, p62 and Beclin-1 in HTR-8/SV-neo cells(±s , n=3)

3.6 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞LC3表達的影響

如圖5所示，對照組細胞LC3熒光染色弱，模型組細胞LC3熒光染色較強，各給藥組細胞LC3熒光染色較模型組降低。

圖5 竹節(jié)參總皂苷對HTR-8/SV-neo細胞LC3表達的影響 (×100)Fig.5 Effect of total saponins from P.japonicus on LC3 expression in HTR-8/SV-neo cells (× 100)

4 討論

近年來HDCP約占妊娠的10%，盡管目前關于HDCP已開展了大量的研究，但HDCP仍然是婦產(chǎn)科中最棘手的難題[2]。HDCP的發(fā)病機制起源于胎盤異常，其中心環(huán)節(jié)是滋養(yǎng)細胞功能異常所致的胎盤生理性障礙。胎盤發(fā)揮著母體與胎兒之間營養(yǎng)物和氧氣交換的作用，從而使胎兒能夠正常生長和發(fā)育。當胎盤功能受損時，胎兒的生長受到影響，從而導致胎兒生長受限[10]。因此，胎盤滋養(yǎng)細胞在HDCP發(fā)病中起著關鍵作用。以一氧化氮合酶抑制劑L-NAME干預人胎盤滋養(yǎng)細胞，可以模擬HDCP的微環(huán)境，從而開展HDCP的相關研究[11-12]。本研究結果顯示，經(jīng)L-NAME處理后，HTR-8/SV-neo細胞活力明顯降低，細胞出現(xiàn)大量的凋亡，表明HDCP中可能會引發(fā)胎盤滋養(yǎng)細胞的生物學功能異常；竹節(jié)參總皂苷能夠提高HTR-8/SV-neo細胞活力，并抑制細胞的異常凋亡現(xiàn)象，表明竹節(jié)參總皂苷對HDCP中的胎盤滋養(yǎng)細胞可能發(fā)揮一定作用。

氧化劑與抗氧化劑的產(chǎn)生以及能力之間的不平衡會導致氧化應激反應。活性氧在組織和器官中的積累會誘發(fā)心血管疾病、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、癌癥、呼吸系統(tǒng)疾病、類風濕性關節(jié)炎以及與妊娠相關疾病的發(fā)生[13-14]。與正常孕婦相比，患有HDCP的孕婦體內(nèi)氧化應激反應增加。SOD和GSH具有抗氧化物酶性質(zhì)，能夠通過協(xié)同清除活性氧和自由基來減輕氧化性損傷；MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，其含量的高低可以體現(xiàn)氧化反應的狀態(tài)[15]。本研究結果顯示，L-NAME干預后HTR-8/SV-neo細胞上清液中SOD和GSH水平降低，MDA水平升高，表明HTR-8/SV-neo細胞發(fā)生了氧化應激反應；竹節(jié)參總皂苷組細胞上清液中SOD和GSH水平升高，MDA水平降低，表明氧化應激反應被抑制。

自噬是細胞內(nèi)分解代謝的穩(wěn)態(tài)機制，可以將細胞內(nèi)組分轉(zhuǎn)移至溶酶體進行降解和氨基酸循環(huán)。Beclin-1是自噬的關鍵調(diào)節(jié)劑，在其啟動和進程中均起著重要作用，可以通過激活各種細胞信號通路調(diào)控自噬發(fā)生；存在于細胞質(zhì)中的p62能夠與經(jīng)泛素化蛋白結合，并與LC3-II結合形成復合物，在溶酶體內(nèi)發(fā)生降解。自噬是維持細胞應激反應穩(wěn)態(tài)的重要機制之一，能夠在早期胎盤缺氧和營養(yǎng)受限的環(huán)境中對滋養(yǎng)層細胞起到重要的保護作用，但過度的自噬可能會破壞細胞結構并誘導細胞發(fā)生異常死亡[16-17]。然而，自噬是否與妊娠相關疾病的胎盤功能障礙的病理過程有關，是否存在由于氧化應激損傷而導致滋養(yǎng)細胞過度自噬，以及這些過程發(fā)生的潛在機制尚待證實。本研究結果顯示，經(jīng)L-NAME干預后，HTR-8/SV-neo細胞LC3熒光染色增強，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平均升高，p62蛋白表達水平降低，表明HTR-8/SV-neo細胞發(fā)生過度自噬；竹節(jié)參總皂苷組LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達水平降低，p62蛋白表達水平升高，表明竹節(jié)參總皂苷能夠改善HDCP中胎盤滋養(yǎng)細胞的過度自噬現(xiàn)象。

FABPs是脂質(zhì)分子伴侶的家族成員，能夠通過調(diào)節(jié)幾種脂質(zhì)信號通路來促進系統(tǒng)性代謝。FABP4在細胞和組織中的異常表達與疾病的發(fā)病機制密切相關，通過特異性抑制劑、中和抗體或未知受體拮抗劑對FABP4功能的藥理修飾將是針對肥胖癥、糖尿病、動脈粥樣硬化等多種疾病的新型治療策略[18-19]。Tu等[20]通過檢測妊娠期前3個月患者血漿中FABP4水平發(fā)現(xiàn)，妊娠早期較高的FABP4水平與妊娠期糖尿病風險增加有關。在肥胖誘發(fā)的非酒精性脂肪肝中，F(xiàn)ABP4表達顯著增加，過氧化酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，PPARγ）具有抑癌基因的作用，而FABP4能夠促進疾病的發(fā)生[21]。本研究結果顯示，經(jīng)L-NAME干預后，HTR-8/SV-neo細胞中FABP4mRNA和蛋白表達水平明顯升高；竹節(jié)參總皂苷顯著抑制FABP4mRNA和蛋白表達水平，表明竹節(jié)參總皂苷可能通過調(diào)控FABP4表達來改善HDCP中胎盤滋養(yǎng)細胞損傷。

綜上所述，竹節(jié)參總皂苷能夠抑制L-NAME干預的胎盤滋養(yǎng)細胞活力降低以及細胞凋亡，并改善細胞的氧化應激損傷與過度自噬，其機制可能與調(diào)控FABP4表達有關。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突