HPLC-CAD法分離測定三金片中同分異構體積雪草苷B和羥基積雪草苷

鄒 準，閔建國，吳敏菊，鐘小清，周艷林，鄒節明

桂林三金藥業股份有限公司，廣西 桂林 541004

三金片由積雪草、金櫻根、金沙藤等5味中藥組成，具有清熱解毒、利濕通淋、益腎之功效，臨床應用于治療急、慢性腎盂腎炎，膀胱炎、尿路感染及慢性非細菌性前列腺炎等泌尿系感染疾病，臨床療效確切，成長為中藥大品種之一。

自《中國藥典》2000年版收載以來，質量標準不斷提升完善，現行標準【含量測定】采用HPLCELSD法測定處方藥味積雪草的主要藥效成分羥基積雪草苷含量[1]。研究進展發現，按照《中國藥典》2020年版方法檢測的羥基積雪草苷，實際混雜有難以分離的同分異構體積雪草苷B[2]。有關二者的分離測定研究，一直是制藥行業的難點，特別是在處方中含積雪草藥材的中成藥制劑中二者的準確定量分析[3-4]和純化分離研究富有挑戰性[5]，2個成分的化學結構式如圖1所示。

圖1 羥基積雪草苷和積雪草苷B的化學結構式Fig.1 Chemical structures of madecassoside and asiaticoside B

為了真實反映其內在質量屬性，本實驗創新性地利用C30色譜柱進行分離，并結合近年來發展應用于無紫外吸收物質檢測的新型通用型電噴霧檢測器（CAD）分析測定了其中積雪草苷B和羥基積雪草苷的含量[6]，結果表明該方法具有靈敏度高、專屬性強、重現性好的特點，可用于本品藥典質量標準的提升研究。

1 儀器、藥品與試劑

1.1 儀器

賽默飛Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀，配三元泵、Corona Veo電噴霧檢測器和變色龍色譜軟件（7.1版），美國賽默飛世爾科技公司；BG-60超聲儀，必能信（上海）有限公司。

1.2 對照品來源及純度

羥基積雪草苷，中國食品藥品檢定研究院，批號110893-201403，質量分數91.4%；積雪草苷B為自制，并按《中藥新藥質量標準研究用對照品研究技術要求》進行了結構確證和純度檢查。

1.2.1 積雪草苷B結構鑒定 白色無定形粉末。mp 217～220 ℃；UV (CH3OH)λmax: 192 nm；IR (KBr)cm-1: 3 418.3 (OH), 2 935.8 (C-H), 1 732.2 (COO-),1 644.3 (C=C), 1 460.3, 1 382.4, 1 262.6, 1 238.0,1 062.9 (C-O), 1 033.8, 812.5；ESI-MSm/z: 1019, 974,503；1H-NMR (400 MHz, C5D3N)δ: 6.32 (1H, d,J=8.0 Hz, -C=CH), 5.12 (12H, 4-CH2OH), 0.98 (3H, d,J= 8.0 Hz), 1.29 (3H, s), 1.83, 1.93 (6H, s), 1.99 (3H,s), 2.17 (3H, s)；13C-NMR (125 MHz, C5D3N)δ: 47.5(C-1), 69.4 (C-2), 78.7 (C-3), 43.2 (C-4), 49.2 (C-5), 68(C-6), 42.1 (C-7), 39.8 (C-8), 49.2 (C-9), 38.6 (C-10),24 (C-11), 123.5 (C-12), 143.9 (C-13), 44.9 (C-14),28.7 (C-15), 24.4 (C-16), 44.9 (C-17), 42.1 (C-18), 47.4(C-19), 31.1 (C-20), 33.4 (C-21), 32.9 (C-22), 66.6 (C-23), 16.4 (C-24), 18.9 (C-25), 19.5 (C-26), 26.4 (C-27),176.9 (C-28), 33.4 (C-29), 24 (C-30), 96.1 (Glu C-1′),74.4 (Glu C-2′), 78.6 (Glu C-3′), 70.7 (Glu C-4′), 76.9(Glu C-5′), 70.7 (Glu C-6′), 105.2 (Glu C-1′′), 75.7 (Glu C-2′′), 76.9 (Glu C-3′′), 78.3 (Glu C-4′′), 76.9 (Glu C-5′′), 61.7 (Glu C-6′′), 103.1 (Rha C-1′′′), 72.9 (Rha C-2′′′), 73.1 (Rha C-3′′′), 74.4 (Rha C-4′′′), 69.4 (Rha C-5′′′), 19.2 (Rha C-6′′′)。上述波譜數據與文獻報道的積雪草苷B數據一致[7]。

1.2.2 積雪草苷B純度檢測 精密稱取干燥至恒定質量的積雪草苷B對照品適量，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成含1 mg/mL積雪草苷B對照品溶液，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，連續測定3次，用歸一化法計算平均質量分數為98.0%，RSD為0.22%，符合定量用對照品純度要求，色譜圖如圖2所示。

圖2 積雪草苷B純度檢測色譜圖Fig.2 HPLC chromatography of asiaticoside B

1.3 藥品與試劑

三金片由桂林三金藥業股份有限公司提供，批號分別為170320、170501、170910、180402、180409、180420、181208、190936、191001、191005、191102。流動相甲醇和乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

采用Thermo AcclaimTMC30色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇-乙腈-水（35∶8∶57）為流動相，柱溫為35 ℃，體積流量為1 mL/min，電噴霧檢測器（corona veo）的氣化溫度為50 ℃。供試品溶液、對照品溶液及缺積雪草陰性溶液的色譜圖如圖3所示。

圖3 積雪草苷B (a)、三金片樣品 (b)、羥基積雪草苷 (c)及缺積雪草陰性樣品 (d) 的HPLC圖Fig.3 HPLC of asiaticoside B (a), Sanjin Tablets sample (b),madecassoside (c), and negative sample without Centella asiatica (d)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取干燥至恒定質量的積雪草苷B和羥基積雪草苷對照品適量，加甲醇溶解并分別稀釋至25、10 mL，配制成質量濃度分別為1.228、3.135 mg/mL的對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取三金片30片（小片）或20片（大片），研細，取約1.0 g，精密稱定，精密加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率250 W、頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過。精密量取續濾液25 mL，回收溶劑至干，殘渣加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 線性關系考察

取“2.2.1”項下各對照品溶液，按5、10、20、25、50倍稀釋配制系列質量濃度的對照品溶液。分別精密吸取上述對照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。以各對照品的進樣量為橫坐標（X），峰面積積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，進行線性回歸，得回歸方程為積雪草苷BY＝33.654 3X－0.034 0，r＝0.999 3；羥基積雪草苷Y＝30.674 8X＋0.768 6，r＝0.998 4。結果表明，積雪草苷B在進樣量0.240 7～2.406 9 μg、羥基積雪草苷在進樣量0.573 1～5.730 8 μg與峰面積呈良好線性關系。

2.4 精密度試驗

取同一批號樣品（批號181208），按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣10 μL，連續進樣6次，計算積雪草苷B和羥基積雪草苷的含量。結果積雪草苷B的平均質量分數為1.80 mg/g，RSD為0.80%，羥基積雪草苷的平均質量分數為4.06 mg/g，RSD為1.78%。

2.5 重復性試驗

取同一批號樣品（批號181208），平行制備6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別測定，結果積雪草苷B的平均質量分數為1.77 mg/g，RSD為1.37%；羥基積雪草苷的平均質量分數為3.98 mg/g，RSD為1.49%。

2.6 穩定性試驗

取供試品溶液（批號181208），分別于制備后0、3、6、9、12、24、48 h的時間間隔測定，結果積雪草苷B平均質量分數為1.79 mg/g，RSD為1.48%；羥基積雪草苷的平均質量分數為3.98 mg/g，RSD為1.11%。

2.7 加樣回收率試驗

取重復性試驗同一批號樣品（批號181208），平行取6份，各約0.5 g，精密稱定，分別精密加入積雪草苷B對照品溶液（質量濃度為1.228 mg/mL）0.6 mL和羥基積雪草苷對照品溶液（質量濃度為3.135 mg/mL）0.7 mL，按“2.2.2”項下方法制備加樣回收供試品溶液，并分別測定和計算加樣回收率。結果積雪草苷B、羥基積雪草苷平均加樣回收率分別為100.26%、98.32%，RSD分別為0.69%、1.78%。

2.8 方法耐用性試驗

取重復性試驗同一批號樣品（批號181208），經不同體積流量（1±0.1）mL/min、不同色譜柱溫（35±4）℃和流動相中乙腈比例（8±1）%單因素影響實驗，以及不同廠家色譜柱（YMC carotenoid C30250 mm×4.6 mm，5 μm；Welch Ultimate?XBC30250 mm×4.6 mm，5 μm和Thermo Scientific AcclaimTMC30250 mm×4.6 mm，5 μm）考察，上述各測定結果與重復性測定樣品中2指標成分測定結果無顯著性差異，RSD小于3%。

2.9 定量限考察

取“2.3”項下羥基積雪草苷和積雪草苷B對照品溶液，加甲醇依次稀釋成適宜的質量濃度，精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，使信噪比為10∶1，結果測得羥基積雪草苷和積雪草苷B的定量限分別為57.308 ng和60.172 ng（羥基積雪草苷對照品溶液的質量濃度為5.730 8 μg/mL，積雪草苷B對照品溶液的質量濃度為6.017 2 μg/mL）。

2.10 樣品測定

取各批次三金片樣品，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液和“2.1”色譜條件測定，結果見表1。可見，11批樣品中積雪草苷B在1.65～3.18 mg/g，羥基積雪草苷在3.49～7.90 mg/g，二者總量在5.14～11.08 mg/g。上述檢測結果表明，三金片中2個指標成分較穩定，低含量批次與高含量批次范圍在2倍以內，且表現出同增同減的關聯性。

表1 11批三金片樣品含量測定結果 (n = 2)Table 1 Determination results of 11 batches of Sanjin Tablets (n = 2)

3 討論

三金片為《中國藥典》2020年版收載品種，其【含量測定】項以羥基積雪草苷作為測定指標，經實驗發現，常規C18色譜柱未能將互為同分異構體的積雪草苷B和羥基積雪草苷有效分離。據文獻報道[8-9]，在流動相添加β-環糊精（β-CD）可以實現二者有效分離，但添加β-CD的流動相存在顯著缺陷，積雪草苷B色譜峰容易受到流動相中β-CD的濃度變化而發生保留時間飄移，且β-CD易導致色譜柱柱壓升高及損耗色譜柱[10]。C30色譜柱采用聚合型的鍵合方式方法，在硅膠表面形成致密的多層C30烷基鏈，因而有比常規單層鍵合的C18色譜柱更長的烷基鏈，有更強的疏水性，因而對非極性溶質的保留能力和分辨率更高，同時對長鏈的異構體有非常好的分離能力，故而張勇等[11]利用C30色譜柱分離齊墩果酸同分異構體有較好的表現。本實驗通過系列研究篩選出C30色譜柱，采用常規流動相，即可實現有效分離并準確評價三金片中積雪草苷B和羥基積雪草苷含量，可供齊墩果烷型和烏蘇烷型同分異構體皂苷的分離測定提供參考，相關的分離原理有待下一步深入研究。

三金片成分復雜，對比了超聲提取、加熱回流提取等不同提取方法，超聲處理30、45、60 min及回流2 h不同提取時間，甲醇、無水乙醇、95%乙醇不同提取溶液的效果，結果表明甲醇50 mL，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）45 min為最簡便高效提取條件。

原標準采用正丁醇提取純化皂苷成分，實際操作繁瑣，且易產生操作誤差，現改進為甲醇超聲處理得到提取液，蒸干后直接采用流動相（甲醇-乙腈-水混合溶劑）進行沉淀除雜純化，能有效富集目標成分，具有效果好、經濟環保、簡單快捷的特點。

本實驗比較了相同液相條件下，C30色譜柱聯合不同類型檢測器（UV、ELSD和CAD）測定二者含量的方法。結果表明，UV檢測法中，檢測波長為210 nm時，色譜圖中的2個目標成分難以達到基線分離，無法進行有效積分；ELSD檢測法中，平行進樣中2個目標成分積分面積偏差較大（重復性實驗RSD為8.5%），特別對含量較低的積雪草苷B影響更為顯著。CAD檢測法具有靈敏度高的特點[12]，適用于紫外吸收較弱的成分檢測，較目前常用的蒸發光散射檢測器靈敏度顯著提高，較紫外檢測器基線干擾小，可以為此類含量偏低吸收偏弱成分的定量檢測提供更好的選擇。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突