結合逐步敲入策略與制劑工藝過程的腎寶片復雜成分辨識

陸 萌，賈曉斌，郭舒臣，易 歡，段龍強，耿 炤*，封 亮*

1.中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198

2.江西匯仁藥業股份有限公司 技術中心，江西 南昌 330052

腎寶片由淫羊藿、紅參、肉蓯蓉等22味中藥組成，具有調和陰陽、溫陽補腎、扶正固本的功效，可用于治療腰腿酸痛、精神不振、夜尿頻多、畏寒怕冷等癥[1]。腎寶片的原劑型腎寶合劑在治療遺尿方面具有很好的療效[2]，并具有助陽的功效與改善性功能的藥理作用[3]。腎寶片是內科常用補益中成藥[4]，但其藥效物質基礎仍不明確，現有研究大多是針對腎寶片中某一單味中藥中的化學成分進行測定[5-7]，缺乏系統的物質基礎研究。腎寶片與腎寶合劑制劑工藝不同，部分化學成分可能會發生變化。已有研究中主要測定了腎寶合劑中的淫羊藿苷、補骨脂素、異補骨脂素及蛇床子素[8]，本研究擬通過對腎寶片化學成分進行進一步辨識，對可能的新產生成分進行解析，有助于對腎寶片制劑工藝過程的理解、認識和進一步的質量控制。

中藥復方藥效物質基礎研究一直是中藥現代化研究的重點內容之一，而對復方中藥進行系統的化學成分表征研究是闡明其藥效物質基礎的前提。中藥復方具有多組分、多靶點、整體性的特點，其藥味眾多、成分復雜，是大復方物質基礎解析的主要難點[9]。近年來對于中藥復方物質基礎的研究，發展出了諸如中藥血清藥物化學研究[10]、譜效相關的藥效物質基礎研究[11]、中藥整體藥代動力學研究[12]等方法，這些方法在闡釋中藥物質基礎方面起到了一定的積極作用。本研究為系統表征腎寶片制劑工藝過程中得到的各提取物的化學成分，采用逐步敲入策略，利用超高效液相色譜（UPLC）與超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質譜（UPLC-Q-TOF-MS）解析各浸膏的化學成分，實現化學成分定性與分類，為腎寶片質量控制提供依據。

按照腎寶片制劑工藝分別得到腎寶片浸膏1、2與全浸膏，采用UPLC重點分析表征浸膏1、2與全浸膏，并按照逐步敲入浸膏1、2的方法，驗證全浸膏中的成分。在初步歸屬全浸膏譜中21個成分后，采用UPLC-Q-TOF-MS技術對腎寶片各提取物（浸膏）化學成分進行定性分析，建立化學成分快速鑒定方法，結合對照品與各單味中藥的相關文獻，快速鑒定未知成分。整體技術路線圖見圖1。該方法較為全面系統地表征了腎寶片提取物的化學成分，為腎寶片的藥效物質基礎研究及質量控制方法的建立提供了實驗依據，對藥味組成復雜的中藥大復方物質基礎解析具有廣泛的應用價值。

圖1 結合逐步敲入策略與制劑工藝過程的腎寶片復雜成分辨識技術路線圖Fig.1 Diagram of identification of complex components of Shenbao Pian based on stepwise knock-in strategy and preparation process

1 儀器與材料

1.1 儀器

Acquity UPLC H-Class超高效液相色譜儀、Waters Xevo G2-XS QTof質譜儀［配有電噴霧電離源（ESI）］、數據處理軟件MassLynx V 4.2和UNIFI，美國Waters公司；KH-300TDB型高頻數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；Metter-Toledo GmbH XPR2電子分析天平，梅特勒-托利多儀器有限公司；Milli-Q純水系統，美國Millipore公司。

1.2 試藥與試劑

對照品人參皂苷Rg1（批號G16S10Y97436）、人參皂苷Re（批號B04D9S76499）、人參皂苷Rb1（批號 Z20S9X70603）、金絲桃苷（批號Y08N9X74602）、槲皮素（批號C09S8Y43412）、蛇床子素（批號T08M8B30733）、類葉升麻苷（批號Y21A9H59554）、補骨脂素（批號C22A9Q68562）、異補骨脂素（批號C05M10Q82078）、大黃素（批號C18F8Q29652）、大黃素甲醚（批號T26A8F34784）、阿魏酸（批號L03A9D57744）、松果菊苷（批號Y29M10H84490）、五味子醇甲（批號Y30N10H104712）均購于上海源葉生物科技有限公司；對照品朝藿定A（批號19072204）、朝藿定B（批號18011604）、朝藿定C（批號19072404）、淫羊藿苷（批號18012906）、寶藿苷I（批號19083008）均購于成都普菲德生物技術有限公司；對照品人參皂苷Ro（批號19012811）、四羥基二苯乙烯葡萄糖苷（批號19012803）均購于維克奇生物科技有限公司；各對照品質量分數均≥98%。

腎寶片及其中間品浸膏1、浸膏2與全浸膏，批號均為T1909156，江西匯仁股份有限公司。乙腈、甲醇為質譜純，德國Merck公司；其余試劑均為色譜級。

2 方法

2.1 對照品溶液的制備

取金絲桃苷、槲皮素、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I、人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加50%乙腈分別制成質量濃度為116.5、219.7、199.2、201.6、164.6、215.4、204.2、217.2、199.0、196.0、165.6 μg/mL的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液1。

取蛇床子素、毛蕊花糖苷、補骨脂素、2,3,5,4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、異補骨脂素、大黃素、大黃素甲醚、阿魏酸、松果菊苷、五味子醇甲對照品適量，精密稱定，加50%乙腈分別制成質量濃度為105.5、196.4、208.3、116.2、207.4、209.0、251.2、190.5、219.7、217.3 μg/mL的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液2，混合對照品溶液1、2用于UPLC分析。

分別取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷I對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成含各成分5～15 μg/mL的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液3。

分別取人參皂苷Rg1、人參皂苷Ro、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re對照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成含各成分5～15 μg/mL的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液4。

分別取松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷、2,3,5,4-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、補骨脂素、異補骨脂素對照品適量，精密稱定，加50%乙腈分別制成含各成分1～5 μg/mL的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液5。

分別取沒食子酸、槲皮素、山柰酚、大黃素、大黃素甲醚、甘草苷、異甘草素對照品適量，精密稱定，加50%乙腈分別制成含各成分1～5 μg/mL的混合對照品溶液，標記為混合對照品溶液6，混合對照品溶液3～6用于UPLC-Q-TOF-MS分析。

2.2 供試品溶液的制備

分別取浸膏1、2和全浸膏各1 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加適量50%乙腈超聲溶解，冷卻至室溫，加50%乙腈定容至刻度，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為浸膏1、2和全浸膏供試品溶液；分別吸取浸膏1、2供試品溶液各1 mL，等體積混合，0.22 μm微孔濾膜濾過，即得浸膏1＋浸膏2供試品溶液；取腎寶片3片，除去包衣，研細，取2 g，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加適量50%乙腈超聲溶解，冷卻至室溫，加50%乙腈定容至刻度，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液作為腎寶片供試品溶液；50%乙腈作為空白供試品溶液。

2.3 液相色譜條件1

Waters H-class液相色譜儀；色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～20 min，10%～20%乙腈；20～20.1 min，20%～24%乙腈；20.1～32 min，24%乙腈；32～32.1 min，24%～30%乙腈；32.1～38 min，30%～38%乙腈；38～42 min，38%～50%乙腈；42～50 min，50%～95%乙腈；50～57 min，95%乙腈；57～65 min，95%～10%乙腈；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長203、270 nm；進樣量1 μL。

2.4 液相色譜條件2

Waters H-class液相色譜儀；色譜柱為Acquity UPLC BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～10 min，5%～15%乙腈；10～15 min，15%～24%乙腈；15～25 min，24%乙腈；25～40 min，24%～60%乙腈；40～45 min，60%～73%乙腈；45～52 min，73%～95%乙腈；52～60 min，95%～5%乙腈；體積流量0.2 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長254 nm；進樣量1 μL。

2.5 液相色譜條件3

Waters I-class液相色譜儀；色譜柱為Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～0.5 min，22%乙腈；0.5～10 min，22%～95%乙腈；10～12 min，95%乙腈；12～12.5 min，95%～22%乙腈；12.5～14 min，22%乙腈；體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量為2 μL；2D檢測波長203、270 nm；用于UPLC-Q-TOF-MS分析浸膏1和全浸膏。

2.6 液相色譜條件4

Waters I-class液相色譜儀；色譜柱為Acquity UPLC HSS T3柱（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脫：0～0.5 min，5%乙腈；0.5～10 min，5%～50%乙腈；10～10.5 min，50%～95%乙腈；10.5～12 min，95%乙腈；12～12.5 min，95%～5%乙腈；12.5～14 min，5%乙腈；體積流量0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；2D檢測波長260、300 nm；用于UPLC-Q-TOFMS分析浸膏2和全浸膏。

2.7 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）正、負離子模式分別進行MSE掃描；低碰撞電壓6 V；高碰撞電壓30～70 V；采集質量范圍m/z50～1200；毛細管電壓3 kV（ESI+）和2.5 kV（ESI-）；錐孔電壓40 V；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣體積流量1000 L/h；掃描時間14 min；亮氨酸腦啡肽（LE）實時校準質量數，正離子為m/z556.277 1，負離子為m/z554.261 5。

2.8 質譜數據分析

使用Masslynx V4.2和以中藥數據庫為基礎的UNIFI軟件進行數據采集與分析。利用Waters Traditional Medicine Library成分庫搜索各單味中藥的化學成分，基于UNIFI在線軟件進行化學成分鑒定與匹配，具體參數設置如下：在查找3D峰模塊勾選采用Lockmass進行校正，高能通道強度閾值設為50 counts，低能通道強度閾值設為200 counts，勾選“Target by Retention time”，Target match tolerance設為5×10-3；Lockmass校正質量數：正離子為m/z556.276 6，負離子為m/z554.262 0。通過人工校驗與核實各化合物的精確相對分子質量以及碎片離子，確定浸膏1、2與全浸膏的化學成分。

3 結果與分析

3.1 逐步敲入浸膏1、2驗證全浸膏中的成分

腎寶片成分復雜，根據不同成分的特點，分別采用液相色譜條件1和2對浸膏1、浸膏2、浸膏1＋2、全浸膏以及混合對照品溶液1、2與腎寶片進行分析，按照逐步敲入浸膏1、2的方法，對全浸膏中的成分及來源進行驗證。

在液相色譜條件1下重點分析了浸膏1中淫羊藿黃酮組分與人參皂苷組分，利用PDA檢測器設置雙波長，分別在270 nm下分析黃酮成分，在203 nm下分析皂苷成分，色譜圖見圖2、3。由圖2可推測腎寶片全浸膏中含有朝藿定A、B、C、淫羊藿苷及寶藿苷I、槲皮素與金絲桃苷，其中朝藿定A、B、C、淫羊藿苷及寶藿苷I來自浸膏1，槲皮素與金絲桃苷可能來自浸膏2。由圖3可知，僅通過保留時間較難推測全浸膏中是否含有人參皂苷Rg1、Re、Ro與Rb1，為進一步驗證浸膏1、2和全浸膏中是否含有上述成分，將利用LC-MS對各浸膏成分進行鑒定。

圖2 驗證全浸膏中成分色譜圖 (液相色譜條件1, PDA: 270 nm)Fig.2 Validation of chromatogram of components in total extractum (liquid chromatography conditions1, PDA: 270 nm)

圖3 驗證全浸膏中成分色譜圖 (液相色譜條件1, PDA: 203 nm)Fig.3 Validation of chromatogram of components in total extractum (liquid chromatography conditions1, PDA: 203 nm)

通過對色譜條件的摸索，在液相色譜條件2下重點分析了浸膏2中的成分，色譜圖見圖4。由于主要成分在前40 min出峰，因此，選取前40 min的色譜圖進行對比，由圖4可推測全浸膏中含有阿魏酸、松果菊苷、二苯乙烯苷、毛蕊花糖苷、補骨脂素、異補骨脂素、五味子醇甲、大黃素、蛇床子素9個成分，其中阿魏酸、松果菊苷、二苯乙烯苷、毛蕊花糖苷、補骨脂素、異補骨脂素、大黃素來自于浸膏2，且浸膏1對其無干擾，五味子醇甲、蛇床子素在浸膏2中的響應很低，需進一步通過液質分析進行驗證。

圖4 驗證全浸膏中成分色譜圖 (液相色譜條件2)Fig.4 Validation of chromatogram of components in the whole infusion (liquid chromatography conditions 2)

3.2 UPLC-Q-TOF-MS分析浸膏1、2與全浸膏中的成分

為進一步驗證全浸膏中是否含有上述21個成分，實現浸膏1、2與全浸膏的化學成分表征，利用UPLC-Q-TOF-MS對各浸膏進行分析。由于浸膏1與浸膏2成分差別較大，因此，分別針對浸膏1與浸膏2建立2個色譜條件，以進行浸膏1與浸膏2的成分特征性分析，浸膏1、2和全浸膏與混合對照品溶液正、負離子模式下基峰離子流圖見圖5、6。由于混合對照品溶液3中主要是淫羊藿黃酮類成分，在正離子模式下響應較好，因此，僅在正離子模式下對其進行分析，混合對照品溶液4中主要是紅參皂苷類成分，在負離子模式下響應較好，因此，僅在負離子模式下對其進行分析。

圖5 浸膏1、全浸膏基峰離子流圖Fig.5 Base peak intensity (BPI) of extractum 1 and total extractum

圖6 浸膏2、全浸膏基峰離子流圖Fig.6 Base peak intensity (BPI) of extractum 2 and total extractum

由圖5、6可知，各浸膏在對應的色譜及質譜條件下均較好的分離，將該原始數據導入UNIFI軟件中，對比參考文獻與對照品，對成分進行鑒定，鑒定結果見表1～4。最終在浸膏1中檢測到17個成分，浸膏2中檢測到58個成分，在全浸膏中檢測到82個成分，實現了各浸膏的復雜成分表征。

表1 浸膏1中化學成分的鑒定 (液相色譜條件3)Table 1 Components identification of extractum 1 (liquid chromatography conditions 3)

4 討論

腎寶片由22味中藥組成，化學成分復雜，分析時各成分之間容易產生干擾，因此，在建立UPLC針對各浸膏建立指紋圖譜時對色譜條件以及溶解樣品的溶劑進行了優化。

考察了流動相中的有機相，乙腈與甲醇相比，腎寶片全浸膏的信噪比有明顯改善，因此，選擇乙腈作為有機相。并采用PDA全波長掃描，選擇最優波長，針對浸膏1中的皂苷及黃酮成分，最終將檢測波長定為270 nm與203 nm，針對浸膏2中松果菊苷、補骨脂素等成分，檢測波長設為254 nm，混合對照品溶液2及浸膏中各成分的響應均較好。由于浸膏中各成分溶解度差異較大，因此，分別考察了水、50%乙腈、75%乙腈以及乙腈作為溶解樣品的溶劑，50%乙腈對各成分的溶解性較好。并對梯度洗脫程序進行了優化，建立了在同一色譜條件下對浸膏中多個成分分析的色譜條件。

表2 全浸膏化學成分的鑒定 (液相色譜條件3)Table 2 Components identification of total extractum (liquid chromatography conditions 3)

續表2

表3 浸膏2化學成分的鑒定 (液相色譜條件4)Table 3 Components identification of extractum 2 (liquid chromatography conditions 4)

續表3

結合腎寶片制劑處方中各單味藥的用量，最終選擇21個成分對浸膏1、2以及全浸膏進行分析，按照浸膏1、2逐步敲入的方式，驗證全浸膏中的成分。在UPLC分析的基礎上，利用UPLC-Q-TOFMS對各浸膏中的成分進行鑒定，由于前期基于多成分分析時建立的UPLC色譜條件分析時間較長，因此，以縮短分析時間、保證分離度為目標，對梯度洗脫程序進行進一步優化。

表4 全浸膏化學成分的鑒定 (液相色譜條件4)Table 4 Components identification of total extractum (liquid chromatography conditions 4)

續表4

續表4

通過對浸膏1色譜條件的優化，將浸膏1的色譜條件優化至14 min。最終，在浸膏1中檢測到17個化合物，所測成分中有9個化合物經與對照品比對得到鑒定；在相同條件下對全浸膏進行分析，在全浸膏中檢測到15個化合物，其中7個化合物經與對照品比對得到鑒定，將此結果與浸膏1成分鑒定結果進行比較，全浸膏中15個成分均在浸膏1中檢測到，即此15個成分均來自浸膏1。

在浸膏2中檢測到58個化合物，其中6個化合物經與對照品比對確認。浸膏2中檢測到的成分主要包括：（1）肉蓯蓉苯乙醇苷組分：松果菊苷、毛蕊花糖苷、異毛蕊花糖苷；（2）黃芪皂苷組分：黃芪皂苷II、黃芪皂苷III、異黃芪皂苷IV、agroastragaloside II、agroastragaloside IV；（3）補骨脂香豆素組分：補骨脂素、異補骨脂素；（4）制何首烏中蒽醌組分：大黃素、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷；（5）甘草黃酮組分：異甘草呋喃糖苷、甘草苷；（6）胡蘆巴皂苷組分：胡蘆巴皂苷Ib、胡蘆巴皂苷Ia、胡蘆巴皂苷Ⅱa；（7）黃芪黃酮組分：異槲皮苷、毛蕊異黃酮等。

在相同色譜及質譜條件下對全浸膏進行分析，并對22味中藥的化學成分進行搜索，通過對正、負離子模式下全浸膏成分鑒定結果進行整理，共定性了82個化學成分，涵蓋了腎寶片中22味中藥，其中12個化學成分來自浸膏1，其余70個成分來自浸膏2，主要包括制何首烏中二苯乙烯苷組分和蒽醌組分、黃芪皂苷組分、補骨脂香豆素組分、胡蘆巴皂苷組分以及甘草黃酮組分等。

本研究利用UPLC建立了各浸膏的指紋圖譜，基于逐步敲入策略以驗證全浸膏中的成分，并利用UPLC-Q-TOF-MS快速、方便、有效地對腎寶片全浸膏化學成分進行定性分析，結合UNIFI中藥數據庫、二級碎片離子信息以及對照品比對，實現了腎寶片各浸膏中復雜成分的快速辨識與歸屬，為腎寶片制劑工藝過程的質量控制提供了實驗基礎。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突