基于UHPLC-Q-Exactive質譜法分析桔紅素在大鼠體內的代謝過程

馬貝貝，婁天宇，梁耀月，王婷婷，李瑞吉，劉金輝，王晨曉，于尚玥，郭玉東，王 晶*，王志斌

1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488

2.北京市藥品檢驗所，北京 102200

3.同仁堂科技發(fā)展股份有限公司，北京 100071

桔紅素（tangeretin），又被稱為橘紅素、蜜桔素、桔皮素或5,6,7,8,4′-五甲氧基黃酮，作為一種天然的多甲氧基黃酮類化合物（polymethoxylated flavones，PMFs），主要存在于蕓香科植物酸橙Citrus aurantiumLinn.和川橘C.nobilisLour.的果皮以及柑橘C.reticulataBlanco.的葉和莖中[1-3]。近年來國內外研究表明，桔紅素具有較強的藥理活性，如可減輕脂多糖誘導的急性肺損傷、抑制氧化應激和炎癥、保護人腦微血管內皮細胞以及抑制鏈脲佐菌素誘導的細胞凋亡等[4-7]。此外，桔紅素還可抗腫瘤、抗癲癇以及阻斷病毒融合、治療拉沙病毒引起的病毒性出血熱，被廣泛應用于食品保健和醫(yī)學研究[8-10]。然而有關桔紅素的體內代謝研究卻鮮有報道，急需一種快速有效的分析方法詳細闡明桔紅素的代謝產物和代謝途徑[11-12]。

超高效液相色譜-高分辨質譜技術（UHPLCHRMS）將色譜分離與質譜結構解析相結合，同時具備高選擇性、高靈敏度及高精準度的獨特優(yōu)勢，使迅速分離成分與結構信息獲取一體化，從而頻繁應用于藥物成分檢測和快速篩查[13-16]。四極桿-靜電場軌道阱高分辨質譜儀（Q-Exactive Orbitrap MS）將四極桿對母離子的高選擇性與提供準確質量數(shù)的高分辨Orbitrap技術相統(tǒng)一，檢出限度小，質量偏差范圍窄，可顯著消除樣品基質的干擾，實現(xiàn)對復雜樣品的定性和定量分析[17-20]。固相萃取法（solid-phase extraction，SPE）是21世紀以來蓬勃興起的樣品前處理技術，可使分離、純化與濃縮同步完成，常被用于多甲氧基類黃酮等柑橘中的有效成分在動物體內的代謝研究[21-23]。

因此，本研究采用SPE法提取生物樣品，純化后通過UHPLC-Q-Exactive MS技術分析桔紅素在大鼠體內的代謝產物，以期剖析其在動物體內的代謝過程。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo Fisher Ultimate 3000超高效液相色譜儀和Q-Exactive質譜（美國Thermo Fisher公司），配有電噴霧離子源（ESI）；Xcalibur 2.1工作站；R200D分子天平（十萬分之一，德國Sartorius公司）；Milli-Q Synthesis超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；KQ-250DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；OASIS HLB C18固相萃取小柱（3 L/60 g，美國Waters公司）。

1.2 試劑

桔紅素對照品（成都曼思特生物科技有限公司，質量分數(shù)＞98%，批號MUST-18012910）；乙腈和甲醇（質譜級，美國Thermo Fisher公司）；甲酸（色譜級，德國Merck公司）。

1.3 動物

SPF級SD大鼠（雄性，200～220 g），購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號SCXK（京）2016-0011。本研究由北京市藥品檢驗所實驗動物倫理委員會審查通過，實驗動物使用許可證號SYXK（京）2015-0033。

2 方法

2.1 供試品溶液的配制

稱取桔紅素對照品480 mg，溶解于16 mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）溶液中。

2.2 色譜條件

色譜柱為Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫25 ℃；流動相為0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脫：0～1 min，5% B；1～3 min，5%～25% B；3～8 min，25%～60% B；8～15 min，60%～80% B；15～20 min，80%～100% B；20～24 min，100% B；24～25 min，100%～5% B；25～30 min，5% B；體積流量為0.30 mL/min；進樣量為2 μL。

2.3 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式，毛細管溫度350 ℃，鞘氣（sheath gas）體積流量275 kPa，輔助氣（aux gas）體積流量138 kPa，噴霧電壓（source voltage）4 kV。碰撞能量（collision energy）40 eV。檢測方式為Full MS/dd-MS2，F(xiàn)ull MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，質量掃描范圍m/z100～1500。

2.4 動物實驗

將16只SD大鼠隨機分為空白組與給藥組，實驗前于SPF級動物房適應性飼養(yǎng)1周（室溫22～26 ℃，濕度40%～70%，12 h晝夜更替），喂藥前禁食12 h，全程不禁水。

給藥組以300 mg/kg的劑量ig給予桔紅素溶液，空白組則ig等量的0.5%的羧甲基纖維素鈉。

2.5 生物樣品采集

待空白組與給藥組大鼠給藥完成后，置于代謝籠中，分別于0.5、1.0、1.5、2.0、4.0 h眼內眥取血約0.5 mL置于肝素鈉抗凝EP管中，靜置15 min，于4 ℃下3000 r/min離心15 min，合并上述5個時間點的上清液，將空白組與給藥組血漿分裝保存（-80 ℃）。分別收集其24 h內排出的尿液與糞便，尿液于4 ℃下3000 r/min離心15 min，收集上清液分裝（-80 ℃）。糞便烘干后研磨粉碎，分別稱取2組糞便粉末各0.5 g，溶解于70%的乙醇中，超聲提取30 min，收集溶液層保存（-80 ℃）。

2.6 SPE處理生物樣品

將固相萃取小柱用5 mL甲醇與5 mL去離子水活化平衡，分別取解凍后的生物樣品（血漿、尿液與糞便）各1 mL加入柱中，依次用5 mL去離子水和3 mL甲醇洗脫，收集甲醇洗脫液，室溫下用氮氣吹干，得到的殘渣用100 μL初始比例流動相（5%乙腈溶液）復溶，渦旋震蕩3 min，13 000 r/min離心15 min（4 ℃），收集上清液進行UHPLC- HRMS分析。

3 結果

3.1 桔紅素對照品的質譜裂解行為分析

在正離子掃描模式下，桔紅素產生準分子離子峰m/z373.127 62，分子式為C20H21O7（誤差為-1.50 ×10-6）。在其ESI-MS2質譜圖中，檢測到的主要二級碎片離子有m/z358 [M－CH3]+、m/z343 [M－2CH3]+、m/z312 [M－2CH3－OCH3]+、m/z327 [MCH3－OCH3]+、m/z297 [M－3CH3－OCH3]+以及m/z345 [M－CO]+。通過對比黃酮類化合物的質譜裂解規(guī)律[24-25]，本研究以連續(xù)丟失CH3與OCH3、中性丟失CO作為此類化合物的在ESI正離子模式下的特異性裂解規(guī)律，以為下一步的代謝產物結構篩選與鑒定提供依據(jù)。桔紅素在正離子模式下的多級質譜圖見圖1，其詳細裂解途徑見圖2。

圖1 桔紅素在正離子掃描模式下的多級質譜圖Fig.1 Multi-level mass spectrum of tangeretin in positive ion scanning mode

圖2 桔紅素對照品在正離子模式下的裂解途徑Figure 2 Cleavage pathway of tangeretin in positive ion mode

3.2 大鼠體內桔紅素的代謝產物分析與鑒定

基于UHPLC-Q-Exactive高分辨質譜技術分析大鼠給藥后的尿液、血漿與糞便，通過對比空白組與給藥組的生物樣品色譜圖，結合桔紅素對照品的質譜碎裂規(guī)律、二級質譜裂解碎片、保留時間、精確相對分子質量以及脂水分配系數(shù)（calculated logP，ClogP），最終鑒定出包括原型在內的28個代謝產物，其中尿液中有18個、血漿中有22個、糞便中有26個。鑒定結果見表1。空白組與給藥組的血漿、尿液與糞便的總離子流圖見圖3。

圖3 大鼠生物樣品的總離子流圖譜Fig.3 Total ion chromatograms of biological samples from rats

表1 大鼠尿液、血漿和糞便中的代謝產物Table 1 Summary of tangeretin metabolites in rat urine, plasma and feces

在正離子掃描模式下，代謝產物M0的色譜保留時間為9.71 min，精確相對分子質量為373.127 66，其質譜碎裂行為與桔紅素對照品類似，結合文獻報道[26-27]，可將其準確鑒定為桔紅素。化合物M13、M19、M23以及M24在正離子模式下均產生m/z為359.112 48的準分子離子峰，較之桔紅素少14（丟失了1分子CH2），由精確相對分子質量推測出它們的分子式都為C19H19O7，在ESI-MS2裂解過程中，它們都產生了m/z344（脫去1分子CH3）、m/z329（脫去2分子CH3）以及m/z311（脫去1分子H2O）的碎片離子，據(jù)此推斷它們都是桔紅素的去甲基化產物。根據(jù)反相色譜的洗脫行為，ClogP值越大的化合物越難被洗脫。因此代謝產物M13、M19、M23和M24分別為5,6,7,8-四甲氧基-4′-羥基黃酮（ClogP，1.80），5,6,7,4′-四甲氧基-8-羥基黃酮（ClogP，2.13），5,6,8,4′-四甲氧基-7-羥基黃酮或5,7,8,4′-四甲氧基-6-羥基黃酮（ClogP，2.23），6,7,8,4′-四甲氧基-5-羥基黃酮（ClogP，3.03）。

代謝產物M11、M18和M27均產生m/z375.107 43的準分子離子峰 [M＋H]+，推測分子式為C19H19O8，其相對分子質量比M13、M19、M23以及M24多16，推測為它們的羥基化產物。在它們的二級質譜圖中都存在m/z345（丟失2分子CH3）、m/z327（失去1分子H2O）和m/z299（中性丟失1分子CO）等離子碎片，因此M11、M18和M27為桔紅素發(fā)生去甲基化反應后的羥基化產物。

化合物M8在正離子模式下的準分子離子峰為m/z535.144 63，推測分子式為C25H27O13，其相對分子質量比M13多176，推測為M13、M19、M23以及M24的葡萄糖醛酸結合產物。在其ESI-MS2裂解過程中檢測到m/z359（丟失1分子葡萄糖醛酸）以及m/z344、329、311等碎片離子，進一步證明其與M13的碎裂行為相似，因此可將M8鑒定為桔紅素去甲基化和葡萄糖醛酸化復合反應產物。同理，M6的相對分子質量551.139 54比M11、M18及M27多176，二級質譜圖中m/z375是由m/z551中性丟失1分子葡萄糖醛酸產生的，又根據(jù)m/z360、345、327等特征碎片將M6鑒定為桔紅素去甲基化、羥基化和葡萄糖醛酸化復合反應產物。

代謝產物M16的準分子離子峰為m/z439.069 33[M＋H]+，推測分子式為C19H19O10S（誤差為-1.47×10-6），比去甲基化桔紅素的理論相對分子質量多80，推測為桔紅素去甲基化和硫酸酯化反應產物。而之后連續(xù)丟失CH3以及中性丟失1分子水（分別產生m/z344, 329, 311）進一步證實了上述推斷。與之相似，化合物M12（C19H19O11S）被鑒定為桔紅素去甲基化、羥基化和硫酸酯化產物。

化合物M1、M3、M9、M15、M17和M25均產生準分子離子峰m/z345.096 98 [M＋H]+，推測其分子式為C18H17O7，分子質量比桔紅素少28，推測為桔紅素雙去甲基化產物。在二級裂解過程中檢測到m/z345、315、330等特征碎片，證明它們的裂解規(guī)律與桔紅素類成分一致[28-29]，故將它們鑒定為桔紅素雙去甲基化反應產物（失去了2分子CH2）。而代謝物M5、M7及M22均產生m/z361.091 88的準分子離子峰，由Xcalibur推測分子式為C18H17O8，相對分子質量較M1多16，推測為M1類同分異構體的羥基化產物。在ESI-MS2質譜碎裂中，m/z361、346、331、328及300等特征離子表明其裂解行為與M1等化合物類似，因此將M5、M7及M22鑒定為桔紅素雙去甲基化和羥基化產物。

在正離子掃描模式下，代謝產物M4產生m/z331.081 38，分子式為C17H15O7的準分子離子峰（誤差為-1.63×10-6）。其實驗相對分子質量較之桔紅素少42，推測是由桔紅素發(fā)生三去甲基化反應生成的。M4主要的二級碎片離子m/z316和m/z301分別是由m/z331連續(xù)丟失CH3基團所產生，而m/z298進一步反映其裂解行為與化合物M1、M13等相似，故將M4鑒定為桔紅素三去甲基化產物。與M5、M11的鑒定方式相同，可將分子式為C17H15O8的M2和M14鑒定為桔紅素三去甲基化與羥基化復合反應產物。

化合物M20和M21的準分子離子峰均為m/z389.123 08 [M＋H]+，推測分子式為C20H21O8，比正離子模式下檢測到的桔紅素（C20H21O7）多了1個氧原子，推測為桔紅素發(fā)生了羥基化反應。在其二級質譜圖中篩選得到的m/z374、359、341和313等離子碎片進一步證實了上述推斷。代謝產物M26產生了m/z403.138 68和分子式為C21H23O8的準分子離子峰（誤差為-2.37×10-6）。其相對分子質量比桔紅素多30，推測桔紅素結構中多了1個甲氧基（-OCH3）。在ESI-MS2質譜圖中，m/z403經(jīng)碰撞誘導碎裂產生m/z388、373（連續(xù)丟失CH3）、m/z355（脫去1分子H2O）、m/z327（中性丟失CO），故將M26鑒定為桔紅素甲氧基化產物。其二級譜圖見圖4。

圖4 代謝物M26的二級質譜圖Fig.4 Secondary mass spectrum of metabolite M26

代謝物M10在6.82 min被洗脫并產生m/z315.122 68的準分子離子峰 [M＋H]+，預測分子式為C18H19O5（誤差為-2.00×10-6）。其相對分子質量比桔紅素少58，而二級譜圖中的特征碎片m/z133表明中性丟失了1分子CO，m/z297、279等產物離子證明其碎裂行為與桔紅素類化合物相同，故推測桔紅素還脫去了1分子甲氧基（-OCH3）。因此將M10鑒定為桔紅素去甲氧基化和脫一氧化碳復合反應產物。其二級譜圖見圖5。

圖5 代謝物M10的二級質譜圖Fig.5 Secondary mass spectrum of metabolite M10

3.3 桔紅素在大鼠體內的代謝途徑分析

通過對比空白組大鼠的血漿、尿液與糞便質譜圖，最終從給藥組大鼠的生物樣品中鑒定出28個代謝產物，其詳細代謝途徑見圖6。綜合分析這些代謝物的轉化途徑，桔紅素在大鼠體內主要發(fā)生去甲基化、羥基化、硫酸酯化、葡萄糖醛酸化、去甲氧基化、甲氧基化、脫一氧化碳以及它們的復合反應等。

圖6 桔紅素在大鼠體內的代謝途徑Fig.6 Metabolic pathway of tangeretin in rats

4 結論

本研究采用固相萃取法處理大鼠的生物樣品（尿液、血漿與糞便），可高效提取其中的代謝產物，使有機溶劑的使用量大大減少、重復性得到進一步優(yōu)化，且操作簡便，避免了多種雜質的干擾。生物樣品經(jīng)純化后，使用UHPLC-Q-Exactive高分辨質譜聯(lián)用技術對大鼠體內桔紅素的代謝產物進行了全面篩選與快速鑒定，基于桔紅素等多甲氧基類黃酮對照品的特征性碎裂行為、通過化合物的精確相對分子質量獲取分子式，使誤差縮小，鑒定結果更為精確。

結果表明，共從給藥組大鼠的生物樣品中鑒定出28個代謝產物。其中鑒定得到的M1、M3、M4及M13等代謝物最為常見，而其后發(fā)生羥基化反應生成的M2、M5與M11，發(fā)生硫酸酯化和葡萄糖醛酸化反應生成的M6、M8和M12進一步剖析了桔紅素深層次的代謝輪廓。而M10（脫甲氧基與一氧化碳）與M26（甲氧基化）則對現(xiàn)有極少數(shù)有關桔紅素的代謝研究作了重要補充。本研究較為詳細地剖析了桔紅素這一類多甲氧基黃酮的代謝機制和中間過程，可為桔紅素下一步的藥理活性、藥動學、毒理學研究及食品保健藥物的開發(fā)提供參考，同時可為其他中藥天然有效成分的代謝研究提供借鑒。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突