TPM4蛋白在結直腸癌及癌旁組織中的差異表達

趙月鳴，韓秀娟，邢德君

(吉林省腫瘤醫院內三科，吉林 長春 130012)

結直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是當代常見消化道惡性腫瘤之一。在我國，結直腸癌的發病率居常見腫瘤的第四位[1-4]，僅次于肺癌、胃癌及肝癌。由于結直腸癌發生機制尚不完全明確，故在結直腸癌的診治方面仍存在困難，發病率、死亡率居高不下。目前，手術治療是結直腸癌最有效的治療方法，非手術治療的方法主要有化療、放療、生物治療及分子靶向治療。在我國，由于大部分患者被確診時已屬中晚期，術后超過1/3的患者出現復發轉移，嚴重影響患者的生活質量、縮短生存期。因此高效篩查、早期診斷和復發的早期檢測是提高結直腸癌的療效和預后的關鍵。原肌球蛋白(TPM)是細肌絲中與肌動蛋白的結合蛋白，是一種調節蛋白，它在肌肉收縮過程中起著很重要的作用，哺乳動物中的4個TPM基因已被確認，即TPM1、TPM2、TPM3、TPM4。目前對TPM4的研究較少，主要集中在腫瘤[5-6]、與肌肉相關疾病[7-9]。腫瘤方面主要局限在與乳腺癌轉移的相關性研究及膀胱癌的相關性研究。本文通過以結直腸腺癌組織、癌旁組織為研究對象，進行雙向電泳和質譜分析，篩選結腸腺癌及癌旁組織之間差異蛋白。對TPM4蛋白進行Western印跡試驗，提示TPM4蛋白可能為結直腸癌的診斷和指導治療以及判斷預后提供了一個新的靶點。

1 資料與方法

1.1一般資料：本試驗需使用新鮮的結直腸癌組織及癌旁正常組織，癌旁正常組織取材需位于癌組織上端，且距離腫瘤邊緣≥5 cm，經術后病理證實為陰性。結直腸癌標本經術后病理確診斷為腺癌，TNM分期Ⅲ期，術前均未接受任何治療。依據上述篩選標準，我院自2018年1月～2019年12月之間收集組織標本23例，每例均包括癌組織及配對的癌旁正常組織。手術時即時取材，清洗干凈，離體后30 min內放入液氮速凍，然后放入-80℃冰箱保存。

1.1.2試劑:固相pH梯度干膠條 (pH3～10.17 cm；pH5 ～8.17 cm)、碘代乙酰胺(IAM)、蛋白質定量試劑盒購自美國Bio-Rad公司，尿素、硫脲、碳酸氫鈉、苯甲基磺酰氟、三羥甲基氨基甲烷、二硫蘇糖醇、3-[(3 -膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸、DNA酶、山羊抗鼠IgG、丙烯酰胺、考馬斯亮藍購自美國Sigma 公司，RNA酶、TPCK修飾的測序級胰酶購于美國Promega公司，蛋白抽提試劑盒購自CWBio公司，TPM4鼠抗人單抗購自英國Abcam公司，脫脂奶粉購自內蒙古伊利集團。

1.2實驗方法

1.2.1樣品總蛋白提取及蛋白濃度測定:從-80℃冰箱中取出少量組織標本，在低溫PBS中將肉眼可見的血洗去，用無菌剪刀將樣本剪碎，在液氮中將樣本研磨成勻漿。分別稱量已研成勻漿的結直腸癌組織及癌旁正常組織各50 mg，分別加入200 μl組織蛋白抽提試劑，放在冰上20 min。4℃，12 000 r/min離心60 min。考馬斯亮藍法(Bradford法)測定上清液中的蛋白質濃度：在595 nm處比色，以標準蛋白含量為橫坐標，A595 nm為縱坐標，為縱坐標繪制標準曲線，測定樣品中蛋白質含量。分裝樣本，置于-80℃冰箱中保存備用。

1.2.2樣品蛋白水解多肽混合物的制備:將凍存的總蛋白樣品放在室溫條件下，至其完全融化。加入3～5倍體積的50 mmol/L碳酸氫氨將總蛋白樣品完全溶解。加入1 mol/L的二硫蘇糖醇(DTT)以還原蛋白質中的二硫鍵，將其調定至終濃度為20 mmol/L；置于56℃，避光1 h；取出后待其溫度降至室溫，加入等量的1M的碘代乙酰胺(IAM)以防止打開的二硫鍵再結合，混勻后調定至終濃度為50 mM；避光30 min；按蛋白：胰酶以50∶1的比例向反應體系中加入測序級胰酶進行酶切，置于37℃水浴，過夜；酶切產物并真空抽干，置于-80℃冰箱中保存。

1.2.3二維色譜與質譜聯用分離并鑒定多肽混合物:用0.1%FA緩沖液溶解樣品，取50 μg上樣，經反相色譜洗脫的多肽用 LTQXL離子肼質譜儀檢測，質譜數據采用Bioworks 3.3.1 SP1軟件，數據庫檢索用SEQUEST法進行以鑒定出相關多肽和蛋白質。用SEQUEST進行數據庫檢索，以鑒定出相關多肽和蛋白質。

1.2.4Western印跡試驗:采用Western印跡試驗對選定的目標蛋白-TPM4的表達情況進行進一步的驗證。BCA法定量蛋白，使每個加樣孔中蛋白量相同。內參照為β-actin。

2 結果

2.1癌組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質譜聯用分析:應用二維液相色譜與質譜聯用技術對結直腸癌組織總蛋白用酶解后所得產物進行分析，將全部多肽數據進行整理，共鑒定出了846個蛋白質。

2.2癌旁組織總蛋白酶解混合物的二維色譜與質譜聯用分析:應用二維液相色譜與質譜聯用技術對癌旁組織總蛋白酶解產物進行分析，將全部多肽數據進行整理，共鑒定出了535蛋白質。

2.3結直腸癌組織與癌旁組織差異蛋白的鑒定:通過腫瘤組織與癌旁組織中蛋白質的豐度變化來界定差異表達的蛋白質，每個蛋白的豐度通過譜圖數來評價。筆者對差異蛋白的譜圖數變化界定標準如下：①腫瘤組織與癌旁組織中蛋白譜圖數的比值≥1；②腫瘤組織與癌旁組織中蛋白譜圖數的差值≥72。

筆者根據上述標準，對比腫瘤組織與癌旁組織的蛋白分析數據，共鑒定出了有顯著差異的蛋白共24個，其中在腫瘤組織中9個蛋白下調表達，15個蛋白上調表達。TPM4蛋白的串聯質譜圖見圖1～5。

圖1 TPM-4蛋白的質譜鑒定：IQLVEEELDRAQER序列肽段的串聯質譜圖

2.4TPM4的Western印跡結果:見圖6。

圖2 TPM4蛋白中KIQALOOOQDEAEDRAQGLQR序列肽段的串聯質譜圖

圖3 TPM4蛋白中KLVILEGELER序列肽段的串聯質譜圖

圖4 TPM4蛋白中KLVILEGELERAEER序列肽段的串聯質譜圖

圖5 TPM4蛋白中RIQLVEEELDRAQER序列肽段的串聯質譜圖

圖6 TPM4的免疫

3 討論

直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。在我國，結直腸癌的發病率和死亡率逐年上升，目前居于第4位，僅次于肺癌、胃癌及肝癌[10-11]。在結直腸癌的發病早期，患者一般無明顯癥狀，且該病早期的診斷率較低，進展較快，當發展到中期、后期，患者才能有明顯或者不明顯的病變特征，喪失了治療的最佳時期，縮短了生存期。因此高效篩查、早期診斷和復發的早期檢測是提高結直腸癌的療效和預后的關鍵。

如何探尋理想的腫瘤標志物，目前最常應用的是蛋白質組學技術，其檢測腫瘤標志物的效率較高，且省時省力。本研究采用了二維色譜與質譜聯用的方法研究了TNMⅢ期結直腸癌組織與癌旁組織之間蛋白表達譜的差異。從結直腸癌組織及癌旁組織差異蛋白水平上探討差異蛋白與腫瘤發生、發展的相關性，從而有助于醫務人員了解結直腸癌發生的機制，尋找早期診斷的新靶點，并為后續的工作奠定基礎。 結果發現有24個差異蛋白，其中在結直腸癌組織中有15個蛋白上調表達，有9個蛋白下調表達。這個結果與本實驗室前期所做的試驗結果[12]相一致，但同其他的一些文獻報道有所不同，分析原因可能有以下幾種可能：①結直腸癌本身就是一種異質性的疾病，每位患者的病例特征均不同，故收集標本的標準不同、選取的標本類型不同、患者自身的因素都可能導致篩選結果的差異；②研究中所應用的方法及實驗手法、試劑、儀器及其他一些干擾因素均存在差異，也會得出不同的結果；③蛋白質組學研究本身所包含的信息量就非常大，研究者們所得出的實驗結果不同是正常的。但不可否認的一點就是，不同的研究者得到的都只是眾多數據中的一部分，還有大量的結直腸癌的蛋白組學信息有待進一步發掘和研究。筆者詳細檢索文獻后發現，實驗中發現的差異蛋白一部分已經得到了驗證[1-3]。本課題組從剩余的差異蛋白中選出TPM4蛋白作為研究蛋白，主要是因為TPM4有一定的生物學功能，在結直癌中沒有報道，而且在生物制品公司可以買到TPM4的一抗。通過Western blot 蛋白質印跡實驗檢測上調蛋白TPM4在結直腸癌組織中的表達，結果可見TPM4蛋白在結直腸癌組織中表達明顯高于配對的癌旁組織，進一步證實了，TPM4在結直腸癌組織中上周表達。