免疫組化烘蠟條件的探討

沈洪武，沈靜華

免疫組化切片的烘蠟條件目前尚無統一的標準。梁英杰主編的《臨床病理學技術》提供的烘蠟條件是62～65 ℃ 60～120 min[1]。北京中杉金橋公司《產品目錄》提供的烘蠟條件是70 ℃ 60 min。來茂德主編的《病理學高級教程》提供的烘蠟條件是60 ℃ 60 min[2]。羅氏診斷產品(上海)公司的清洗液說明書提供的烘蠟條件是65～75 ℃ 2～24 h。Dako公司IHC Microscope Slides說明書提供的烘蠟條件是切片在室溫下完全干燥后，56～60 ℃ 20～60 min。在實際工作中，烘蠟條件為60～70 ℃ 60 min，部分組織易脫片(例如子宮頸錐切組織和乳腺組織)；烘蠟條件為65～75 ℃ 120 min，組織不會脫片，但是太耗時，影響病理診斷時效(DAKO公司的烘蠟總時長也會超過120 min)。本科室對不同的烘蠟條件進行試驗，并通過130種抗體，歷經8個月完成56 000張切片的實用測試，發現65 ℃ 120 min、75 ℃ 60 min、85 ℃ 30 min均是可行的免疫組化烘蠟條件，綜合考慮烘蠟時間，認為85 ℃ 30 min對免疫組化結果影響較小、效果佳，值得臨床推廣應用，現介紹如下。

1 材料與方法

1.1 材料收集福建醫科大學附屬漳州市醫院病理科存檔的乳腺組織蠟塊(HER-2 3+)和子宮頸錐切組織蠟塊各30例。正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，正電荷親水型防脫載玻片2號(日本松浪公司，PRO-04)，正電荷親水型防脫載玻片3號(Dako公司，K8020)。電熱恒溫鼓風干燥箱(上海躍進醫療器械公司，GZX-GF-MBS-2)。羅氏全自動免疫組化染色儀(BenchMark ULTRA IHC/ISH Staining Module)。PR(羅氏公司，790-4296 E22157)，HER-2(羅氏公司，790-4493 E16719)，Ki-67(羅氏公司，790-4286 E30677)，EMA(福州邁新公司，Kit-001119040205 816)，EDTA抗原修復液(福州邁新公司，MVS-0098190314 4251)，蘇木精(福州邁新公司，CTS-1090 1903190459)，UltraView Universal DAB(羅氏公司，790-500 E18998)。

1.2 方法上述組織蠟塊4 μm厚切片，分別裱貼于上述防脫載玻片，分組烘片(表1)。

表1 組織切片分組和組織防脫試驗

1.2.1 組織防脫試驗上述分組烘片常規脫蠟水化，用EDTA(pH 9.0)高壓抗原熱修復(壓力鍋噴汽2 min，棄火置5 min，冷水浴至室溫)，蘇木精染色，干燥封片，觀察組織的完整性，組織有破損為(+)，組織完好為(-)。

1.2.2 烘蠟溫度試驗烘蠟時間為60 min，烘蠟溫度分別為75、85、95 ℃的分組，烘蠟條件65 ℃ 120 min為對照組，選用正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，在羅氏全自動免疫組化染色儀上進行PR、EMA、Ki-67、HER-2的免疫組化染色，與對照組比較，觀察顯色強弱情況和顯色定位情況，以判斷組織抗原在不同的烘蠟溫度下是否有影響。

1.2.3 烘蠟時間試驗烘蠟溫度為85 ℃，烘蠟時間分別為30 min、60 min、120 min、24 h的分組，烘蠟條件85 ℃ 30 min為對照組，選用正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，在羅氏全自動免疫組化染色儀上進行PR和HER-2免疫組化染色，與對照組比較，觀察顯色強弱和顯色定位情況，以判斷組織抗原在不同烘蠟時間下是否有影響。

1.2.4實用性試驗 以85 ℃ 30 min作為烘蠟條件，選用正電荷親水型防脫載玻片1號(漳州武德生物公司，U-004)，在羅氏全自動免疫組化染色儀上，抗體包括ER、PR、HER-2、CD20、ALK(D5F3)、CD117、DOG1、PD-L1、Syn、CgA、Ki-67、p53等130種，耗時8個月對56 000張切片進行免疫組化染色，上述12種抗體均同片貼陽性外對照，其它抗體作陽性外對照，觀察顯色強弱和顯色定位情況，并觀察組織的完整性，判斷130種抗體在85 ℃ 30 min烘蠟條件下的免疫組化染色是否正常顯色和組織防脫性。

2 結果

2.1 組織防脫試驗結果烘蠟條件：溫度65 ℃，時間≥120 min，或溫度75 ℃，時間≥60 min，或溫度85 ℃，時間≥30 min，或溫度95 ℃，時間≥15 min，組織均完好不脫片；溫度65 ℃，時間<120 min，或溫度75 ℃，時間<60 min，或溫度85 ℃，時間<30 min，組織均會有不同程度脫片；不同公司三種防脫載玻片在相同的烘蠟條件下，組織防脫性差異無統計學意義(表1)。

2.2 烘蠟溫度試驗結果烘蠟時間為60 min，烘蠟溫度分別為75、85、95 ℃的PR、EMA、HER-2和Ki-67的免疫組化染色結果與對照組比較，顯色強弱情況和顯色定位情況差異無顯著性(圖1)。

圖1 A.對照組HER-2：烘蠟條件65 ℃ 120 min；B.試驗組HER-2：烘蠟條件75 ℃ 60 min；C.試驗組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 60 min；D.試驗組HER-2：烘蠟條件95 ℃ 60 min

2.3 烘蠟時間試驗結果烘蠟溫度為85 ℃，烘蠟時間分別為60、120 min的PR和HER-2免疫組化染色結果與對照組比較，顯色強弱和顯色定位情況差異無顯著性。烘蠟時間為24 h的PR和HER-2免疫組化染色結果與對照組比較，顯色有輕微減弱，顯色定位情況差異無顯著性(圖2)。

圖2 A.對照組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 30 min；B.試驗組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 60 min；C.試驗組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 120 min；D.試驗組HER-2：烘蠟條件85 ℃ 24 h

2.4 實用性分析烘蠟條件為85 ℃ 30 min，130種抗體的陽性對照組織的免疫組化染色顯色強，定位準確，56 000張切片免疫組化染色均能正確輔助病理診斷，并且組織均完整無脫片。

3 討論

由于免疫組化切片的烘蠟條件目前無統一標準，免疫組化技師常使用的烘蠟條件是65 ℃ 60 min，結果顯示有些組織易脫片。組織防脫試驗證明免疫組化可行的烘蠟條件是65 ℃ 120 min，或75 ℃ 60 min，或85 ℃ 30 min，或95 ℃ 15 min。

3.1 烘蠟溫度烘蠟條件為95 ℃ 60 min，對組織抗原的不利影響不顯著。脫蠟后的組織切片經65 ℃ 60 min，則組織抗原被明顯破壞。因此，作者認為組織抗原在熔蠟的保護下，能夠耐受95 ℃ 60 min。因此，免疫組化烘蠟條件為85 ℃ 30 min，對組織抗原是安全的。

3.2 烘蠟時間烘蠟條件為85 ℃ 120 min，對組織抗原的不利影響不顯著；烘蠟條件為85 ℃ 24 h，會使組織抗原輕微的損失。因此，烘蠟溫度為85 ℃時，烘蠟時間<120 min，對組織抗原是安全的。

3.3 實用性烘蠟條件為85 ℃ 30 min，經本免疫組化室8個月56 000張切片的實用免疫組化染色，130種抗體的陽性外對照均強顯色，準確定位。實踐證明烘蠟條件為85 ℃ 30 min對組織抗原幾乎沒有損壞，切實可行，為免疫組化染色縮短了時間，可提高病理診斷的效率。

3.4 注意事項干燥箱應提前升溫到恒定85 ℃。干燥箱門打開時間不宜太長，以免溫度驟降。計時期間，為了恒定85 ℃，干燥箱門不宜打開。正在烘蠟的多架切片不宜緊密排列，架子之間要有適當間隔，從而使所有切片快速均勻受熱。

綜上所述，65 ℃ 120 min、75 ℃ 60 min、85 ℃ 30 min均是可行的免疫組化烘蠟條件，考慮烘蠟時間，認為85 ℃ 30 min對免疫組化結果影響小、效果佳，是值得推廣應用的烤片溫度和烤片時間，各單位可以根據實際情況進行適當調整。