巴氏染色后的涂片褪色行抗酸染色在結(jié)核診斷中的應(yīng)用

楊 眉，陳 昱，唐 源

WHO《2017年全球結(jié)核病報告》指出：結(jié)核病仍然是全球主要的傳染病殺手，中國的發(fā)病率僅次于印度和印度尼西亞。結(jié)核病菌會嚴(yán)重傷害機體的各個器官和組織，臨床癥狀復(fù)雜，尤其肺外結(jié)核，病情表現(xiàn)為隱匿性變化或缺乏典型癥狀，臨床易誤診和漏診。結(jié)核診斷方法包括：臨床癥狀、影像學(xué)檢查及病原體檢測、結(jié)核血清學(xué)檢測、抗酸桿菌染色、結(jié)核桿菌基因檢測等。病理科日常工作中診斷結(jié)核的主要方法為齊-尼(Ziehl-Neeslen)抗酸染色和結(jié)核桿菌熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)，雖然大部分患者可通過上述兩種方法確診，但本科室統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)每年約10%的細胞學(xué)患者因取材困難、病灶小等原因?qū)е陆M織較少，僅能進行單張巴氏染色涂片，無多余涂片進行抗酸染色和qPCR檢測，本實驗嘗試用巴氏染色涂片褪色行抗酸染色，探討該方法對診斷結(jié)核病的實用價值。

1 材料與方法

1.1 材料收集四川大學(xué)華西醫(yī)院2013～2018年常規(guī)細胞學(xué)診斷中建議行抗酸染色的細針穿刺及脫落細胞學(xué)病例134例，本組收集的細胞樣本巴氏涂片鏡下特征為較多淋巴細胞、中性粒細胞、上皮細胞、肉芽腫性炎伴或不伴壞死。

1.2 主要試劑堿性復(fù)紅無水乙醇飽和液，5%石炭酸溶液，3%硫酸木醇溶液，美藍溶液，二甲苯，乙醇。

1.3 對照設(shè)置每次實驗均設(shè)置陽性對照、空白對照、陰性對照。

1.4 方法(1)褪色：巴氏染色涂片室溫下浸入二甲苯1～2 min，摘去蓋玻片，洗掉封片膠。再依次入無水乙醇、95%乙醇、80%乙醇內(nèi)數(shù)秒，自來水洗。入1%鹽酸乙醇褪色3～5 min至涂片顏色變淺，自來水洗。(2)染色：在涂片上滴加石炭酸復(fù)紅溶液2～3滴20 min；3%硫酸木醇分化至切片上的紅色不再脫落為止，約30 s；水洗。用美藍溶液對比染色2～3 s，水洗。常規(guī)脫水，透明，封片。

1.5 結(jié)果判斷抗酸桿菌呈鮮紅色，長1.3～3.0 μm，紅染，不折光，呈稍彎曲的微細桿狀物，或為稍彎曲的念珠樣細桿狀物，與組織切片位于同一水平面上。其它細菌及細胞核呈藍色。

2 結(jié)果

抗酸桿菌呈紅色，背景呈灰紅色(圖1、2)。本組134例疑似結(jié)核病例，巴氏染色涂片褪色行抗酸染色查見結(jié)核桿菌率為39.6%(53/134)。抗酸染色陽性病例中男性21例，女性32例，年齡18～85歲，中位年齡31歲。53例陽性患者中42例為外院患者至我院行細胞學(xué)篩查確診結(jié)核，11例為本院住院患者。81例抗酸染色陰性患者中，35例為肉芽腫性炎伴或不伴壞死，其中29例為門診患者無法追蹤，6例住院患者臨床診斷為結(jié)核并進行抗癆治療。53例陽性病例中22例為肉芽腫性炎伴或不伴壞死(表1)。

圖1 頸部淋巴結(jié)穿刺涂片巴氏染色后褪色做抗酸染色，箭頭所示為結(jié)核桿菌 圖2 胸水細胞塊石蠟切片行抗酸染色，箭頭所示為結(jié)核桿菌

表1 134例疑似結(jié)核病例巴氏染色涂片褪色行抗酸染色病例分布

3 討論

國內(nèi)首次報道細胞學(xué)巴氏染色涂片褪色行抗酸染色，孫亞欣等[1]的實驗中組織學(xué)抗酸染色陽性率為39.81%(43/108)，與本組陽性率較接近。本組134例疑似結(jié)核病例中，頸部淋巴結(jié)是結(jié)核例數(shù)最多的部位，各年齡段均可發(fā)生，以20～40歲青中年最多見，女性多于男性，與劉潔等[2]報道的結(jié)果一致。本組中腋窩淋巴結(jié)抗酸染色陽性率高于頸部淋巴結(jié)，但腋窩淋巴結(jié)病例數(shù)較少，不宜作比較。57例肉芽腫性炎中28例為結(jié)核，與王秀娥等[3]報道結(jié)果一致，即在結(jié)核性肉芽組織中一般很少找到抗酸桿菌。

從染色原理分析，巴氏染色主要有三種染料：(1)蘇木精對染色質(zhì)有親和力，其功用就是染細胞核。(2)橙黃G是單色染料，專染角質(zhì)蛋白，使其染為發(fā)亮的橙黃色。(3)EA是多彩染料，其中伊紅專染成熟的鱗狀上皮細胞；亮綠專染代謝活躍的細胞。上述顏色均可使用鹽酸乙醇褪色。而抗酸染色原理是由于分枝桿菌細胞壁含脂質(zhì)較多，其中主要成分為分枝菌酸，此物具有抗酸性，染色時與石炭酸復(fù)紅結(jié)合牢固，能抵抗酸性乙醇的脫色作用，因此抗酸菌能保持復(fù)紅的顏色，達到染色目的。巴氏染色著色于細胞核及胞質(zhì)，抗酸染色著色于抗酸桿菌，兩者著色對象不同。

在實際工作中需要注意：(1)鹽酸乙醇浸泡涂片褪色過程中需要定時觀察褪色情況并及時終止，避免掉片。(2)二甲苯可明顯降低結(jié)核分枝桿菌的抗酸性[4]，使用二甲苯退去載玻片時浸泡時間不宜過長，推薦少于5 min。(3)針對細胞量少、血液和黏液多的樣本可以采用液基細胞學(xué)技術(shù)制作涂片，可使細菌的采集量大大增加，細胞形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)保持良好，背景清晰，樣本利用率高，亦可用液基涂片行抗酸染色。此外，若在脫落細胞及細針穿刺制片中，可以有適合樣本制作細胞塊，進行核酸提取加做結(jié)核桿菌qPCR檢測，同時應(yīng)用兩項檢查可以提高檢出率[5]。

綜上所述，由于細胞學(xué)獲取的組織少且結(jié)核桿菌呈灶性分布，可能多張涂片中僅有1張為陽性片，巴氏染色涂片褪色行抗酸染色可作為結(jié)核診斷的輔助檢查方法。