超聲組織處理儀在胃鏡標本HE及幽門螺桿菌PCR檢測中的應用

向 雙，段 松，袁懷志，沈昌瓊

近年來，大量研究顯示我國高達50%人群感染幽門螺桿菌(helicobacter pylori, HP)。隨著內鏡技術在各級醫院的廣泛開展，胃鏡已成為常規體檢項目。對于胃鏡初步檢查有問題的患者需進一步行病理檢查明確診斷，但出具病理報告需較長時間。為滿足患者對報告時限的需求，有的病理科會根據組織類型和大小編輯不同處理程序或更換不同的處理試劑[1]，來加快報告速度，但耗時也需10～14 h，而運用快速超聲組織處理技術則不到2 h。目前，快速組織處理儀的應用已經有相關報道，但對于在常規工作中量大且時限要求短的胃鏡組織中卻鮮有報道。本實驗選取同一組織來源的胃鏡標本使用超聲組織處理技術，觀察其處理效果能否達到與傳統方式一樣效果，并對HE染色和HP檢測結果進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1組織來源 選取重慶大學附屬三峽醫院病理科，2019年6月內鏡醫師診斷為胃炎并送檢2塊胃組織的患者，共40例80個蠟塊，分為實驗組和常規組，每組40個蠟塊。其中男性23例，年齡(59±10)歲；女性17例，年齡(56±11)歲。

1.1.2主要儀器和試劑 常規組：賽默飛Excelsior AS自動組織脫水機、10%中性福爾馬林(無錫江原實業公司)、無水乙醇(重慶川東化工公司)、環保透明劑[2](武漢宏茲生物公司)、切片石蠟56～58 ℃(滬試)。實驗組：深圳美雅潔MAGTS-1200超聲快速組織處理儀、美雅潔組織固定、脫水、透明三合一復合試劑、切片石蠟56～58 ℃(滬試)。熒光定量儀：賽默飛Qubit4.0、羅氏CobasZ480熒光定量PCR分析儀、DAKO CoverStainer全自動HE染色機、石蠟包埋組織基因組DNA提取試劑盒(北京厚生博泰公司)、HP核酸檢測試劑盒(北京新基永康公司)。

1.2 方法

1.2.1取材方法 將同一患者胃竇部位2塊組織，取材時分別放入2個包埋盒，每盒一塊，分為常規組和實驗組，實驗組在編號后加字母S便于區分。

1.2.2組織處理方法 常規組：采用常規程序，經賽默飛Excelsior AS自動組織脫水機進行處理，全部完成需要約14 h。實驗組：采用快速超聲組織處理儀。(1)開啟儀器，將標本放入脫水缸；(2)選擇內鏡組織程序，儀器加熱至20 ℃處理8 min，加熱至50 ℃處理40 min，自動降溫到35 ℃處理4 min，即完成固定脫水透明；(3)將標本架轉入蠟缸，啟動浸蠟程序，62 ℃處理5 min，63 ℃處理10 min。全部完成共需約70 min。兩組處理完成后均進行包埋切片，所用試劑和處理程序見圖1。

圖1 兩種處理儀流程圖

1.2.3HE染色 每個蠟塊連續4 μm厚切片3張攤在一張玻片上。同時上載到Dako CoverStainer自動染色機[3]，選擇相同程序進行染色。

1.2.4DNA提取及濃度檢測 將每個蠟塊均連續5 μm厚切片10張，放入EP管中，此過程每切1個標本均進行清潔消毒，防止交叉污染。石蠟包埋組織基因組DNA提取按試劑盒說明書操作。提取完成后，將每例樣本使用熒光定量儀檢測DNA濃度，并編號登記。

1.2.5PCR檢測 使用羅氏CobasZ480PCR分析儀進行檢測，HP核酸檢測[4]按照試劑盒說明書進行程序設定。將兩組共80例樣本全部上機，按編號順序依次加樣至96孔位PCR反應板。每批次加陰性、陽性、臨界陽性3個外標對照品。實驗全程按照同一操作規程進行，嚴格遵守臨床基因擴增檢驗工作導則及實驗操作規范。

2 結果

2.1 HE染色結果兩組切片均用HE自動染色機染色，共80張切片，經1名技師、1名醫師根據《臨床技術操作規范(病理學分冊)》切片質量標準結合染色滿意度、切片完整無刀痕等指標進行盲評打分。73張切片評分達90分，為甲級片。7張切片未達到甲級標準。兩組HE染色效果見圖2、3，兩組甲級片符合率差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

圖2 常規組HE染色 圖3 實驗組HE染色

表1 兩組HE、PCR檢測結果

2.2 DNA濃度結果80個標本均成功提取DNA，依次使用賽默飛Qubit4.0熒光定量儀進行DNA濃度測定，所得結果中有6個標本濃度低于50 ng/μL，兩組結果差異無統計學意義(P>0.05，表2)。

表2 兩組DNA濃度

2.3 PCR檢測結果兩組標本各40例使用羅氏CobasZ480 PCR分析儀進行檢測，根據PCR反應圖(圖4、5)可以看出兩組中內部質控曲線在FAM和VIC兩種熒光素下信號均有明顯增長，有典型的S曲線，且Ct值<35.00表現出良好一致性。兩組結果根據標準判讀，其陽性檢出率差異無統計學意義(P>0.05，表1)。

圖4 兩組PCR反應圖FAM通道

圖5 兩組PCR反應圖VIC通道

3 討論

組織標本前固定在整個病理流程中至關重要，是常規診斷及后續免疫組化和分子檢測的前提。這就必須保證取材前固定時間充足[5]，因此兩組標本均是在鉗取組織后立即固定于10%中性福爾馬林。每組標本所用處理程序保持不變，對試劑濃度進行嚴格監測，確保標本處理質量。本組特選取同一病例、多塊組織的標本作為分析對象，排除組織異質性對實驗結果的干擾[6]。兩組HE染色共有7例未達甲級片標準，分析原因是由于取材部位不佳標本量少，導致切片染色不佳；兩組各有3例DNA濃度低于50 ng/μL，其原因是標本體積過小，組織處理后效果較差DNA含量較低。兩組方法從取材到PCR檢測均同一人員按相同標準流程操作，保證了實驗過程的一致性。綜上，通過比較分析可以發現胃鏡標本使用兩種不同的組織處理儀，其HE染色表現、PCR反應曲線情況以及CT值各指標均無明顯差異，與熊克美等[7]的報道相符。此項技術的應用可以較大程度彌補傳統組織處理儀的缺點，能有效解決病理科常規工作中門診報告及時性的問題。為將來HP的精準治療個體化用藥檢測提供了相關經驗，有了快速發出報告的基礎條件，通常1～2天就能出具常規和分子檢測報告[8]。在病理科實驗室建設的大環境下，該方法能解決工作所需，可滿足患者迫切取報告的需求，有較好的經濟效益和社會效益，值得推廣應用。