快速床旁評估對肺癌患者病理診斷和基因檢測路徑優化的作用

占蒙娜，于 娟，張小壘，侯英勇

肺癌是常見的呼吸系統惡性腫瘤，其發病率和病死率在全球范圍內都較高，每年約160萬人死于肺癌，其5年生存率約15%[1]。近年來肺癌驅動基因相關研究及檢測方法日漸成熟，對肺癌尤其非小細胞肺癌的靶向治療極其重要。NCCN指南建議具有驅動基因敏感突變的肺癌患者可使用靶向治療作為一線治療[2]。因此肺癌患者的病理診斷及驅動基因突變檢測重要且迫切。

常規的診斷流程需先進行石蠟組織包埋切片制備、常規組織學病理診斷，再行分子檢測，該流程中基因檢測周期較長。病理醫師使用快速床旁評估(rapid on site evaluation, ROSE)技術，可于現場通過細胞學診斷向臨床醫師溝通穿刺操作是否成功，且制作切片和診斷過程中不造成組織標本的損失[3-4]，為后續的基因檢測提供新鮮的標本，一定程度上縮短了分子診斷時間，使患者更快得到診療報告從而進行后續治療。本文采用ROSE技術獲取病理診斷，并評估樣本情況，依據樣本情況將組織立即送與分子診斷室行肺癌相關多基因檢測，并將此種方法與常規流程的檢測周期進行對比，探討結合ROSE評估方法對肺癌基因檢測周期的影響。

1 材料與方法

1.1 材料收集2019年7月～2020年7月復旦大學附屬中山醫院收治的肺部占位性質不明及部分局部晚期肺癌患者，評估其是否可行支氣管鏡檢查獲取病變組織樣本進行基因檢測后，進行支氣管鏡采集樣本和ROSE技術判定病變病理學類型，標本足夠后續基因檢測者34例，列為ROSE組。其中14例樣本充足的病例同時進行常規組織學病理流程送檢，列為常規組。34例患者臨床病理特征：男性21例，女性13例；年齡>60歲者24例，≤60歲者10例；腫瘤直徑>3 cm者17例，≤3 cm者15例，其中2例腫瘤直徑未知；臨床分期Ⅰ期5例，Ⅱ期1例，Ⅲ期8例，Ⅳ期19例，1例分期未知；34例患者診斷為腺癌18例，鱗狀細胞癌3例，非小細胞肺癌3例，低分化癌3例，小細胞癌1例，轉移性低分化癌1例，轉移性腺癌5例。

1.2 方法

1.2.1ROSE 經纖維支氣管鏡活檢得到的組織涂片2張，其中1張固定染色，由病理科醫師閱片，給予病理診斷，病理診斷為惡性病變的病例且滿足病理學評估(腫瘤細胞≥100個)時，則將另1張涂片上的組織刮取入EP管中，直接進行基因檢測。

1.2.2常規病理流程 14例標本組織塊較大，且腫瘤細胞較豐富，進行常規組織病理送檢，固定、脫水透明、浸蠟包埋，切片染色，病理醫師進行病理診斷，有需要的加做免疫組化明確診斷，標本滿足病理學評估標準者進行后續分子病理基因檢測。病理醫師采用雙盲法對兩組樣本進行病理診斷及基因檢測。

1.2.3核酸抽提 ROSE組34例細胞學涂片使用廈門艾德公司的DNA/RNA核酸共提試劑(新鮮組織)提取DNA和RNA。常規組14例福爾馬林固定石蠟包埋標本(formalin-fixed and parrffin-embedded, FFPE)使用廈門艾德公司的DNA/RNA核酸共提試劑(FFPE組織)提取DNA和RNA。分別使用nanodrop微量分光光度計測定DNA和RNA的濃度及OD260/280。將抽提的RNA逆轉錄為cDNA。

1.2.4基因檢測 ROSE組和常規組均使用廈門艾德公司的ARMS法多基因突變檢測試劑盒進行基因檢測。該試劑盒可檢測EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA、NRAS、ERBB2基因熱點突變，c-MET基因14號外顯子跳躍突變以及ALK、ROS1、RET融合基因，具體突變列表見表1、2。具體操作步驟和結果判讀參考試劑盒說明書進行。

表1 ARMS法多基因突變檢測試劑盒具體突變位點：ALK及ROS1

1.2.5檢測周期計算 檢測周期定義為從進行纖維支氣管鏡檢查操作，采集臨床標本到分子病理檢測報告發出的工作日。期間應包含病理診斷報告的出具，計算每份標本的檢測周期。

1.3 統計學分析使用SPSS 18.0軟件進行統計學分析，用t檢驗分析ROSE組和常規流程組檢測周期的差異。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特點ROSE組34例標本中，腺癌18例，鱗狀細胞癌3例，非小細胞癌-非特殊型3例，低分化癌3例，小細胞癌1例，轉移性腺癌5例，轉移性低分化癌1例。常規流程組14例標本的病理診斷和ROSE診斷結果一致。

2.2 基因檢測ROSE組34例標本中EGFR基因突變20例，其中19號外顯子突變13例，21號外顯子L858突變5例、L861Q突變1例，18號外顯子G719X突變1例；KRAS基因突變2例，未檢出突變12例(圖1)。常規組14例標本中EGFR基因突變9例，其中19號外顯子突變6例，21號外顯子L858突變2例、L861Q突變1例；KARS基因突變1例，未檢出突變4例。兩組結果比較，ROSE組的檢測結果與常規組一致，突變基因檢測符合率達100%，且突變位點的符合率也達100%。

表2 ARMS法多基因突變檢測試劑盒具體突變位點：EGFR、KRAS及BRAF

圖1 ROSE組檢測到基因突變

2.3 檢測周期ROSE組34例基因檢測周期為0.19～6.22天，平均2.84天，常規組檢測周期為3.00～15.03天，平均7.89天，兩組檢測周期差異有顯著統計學意義(P<0.000 1，圖2)。其中ROSE組中有5例最終報告檢測周期小于24 h，而常規組檢測周期最長者需要15天。

圖2 ROSE組基因檢測周期顯著低于常規組

3 討論

肺癌進展迅速，約70%非小細胞肺癌患者在首次診斷時已處于進展期，喪失了手術機會，預后差，病死率高[5-6]。對于晚期患者常采用穿刺等介入檢查手段進行病理診斷和后續基因檢測，進而及時進行靶向治療。因此介入檢查后的病理診斷及基因檢測周期的優化十分重要。常規診療模式是首先進行常規病理診斷，再行分子病理檢測。基因檢測周期過長，臨床診療的效率較低。此時，分子病理診斷與常規病理診斷具備同等重要的價值，對于基因檢測周期的進一步優化顯得尤為重要[7]。

本實驗采用ROSE技術收集新鮮組織樣本，并通過ARMS法多基因檢測進行肺癌標本病理診斷和基因檢測的優化路徑，優化后的檢測路徑平均檢測周期顯著少于常規檢測路徑。美國病理學會等分子病理基因檢測指南建議基因檢測周期應≤10天[8]，該綜合手段的應用使得檢測周期遠遠低于指南建議的時間。本組還探討ROSE技術下病理診斷的準確性、樣本的核酸質量和ARMS法多基因檢測的實際臨床應用價值，確保新檢測路徑下肺癌標本病理診斷和基因檢測及時、準確而又全面。

本組還選取14例同時進行ROSE優化路徑和常規路徑檢測的樣本，結果顯示其具有完全一致的病理診斷和基因檢測結果，證實ROSE技術可以得出可靠的病理診斷結果。ROSE取得的樣本為新鮮組織，提取的DNA和RNA質量均較好，所以分子病理結果也和常規路徑一致。既往文獻中亦證實ROSE技術對常規病理診斷無明顯負面影響，而有利于及時對標本進行腫瘤細胞評估，減少穿刺次數，也為后續的分子病理檢測提供便利[4,9]。值得一提的是，新鮮組織RNA質量優于石蠟包埋組織，在檢測融合基因和跳躍突變方面具有更明顯的優勢，但本組病例數較少，尚未表現出這種差異。隨著該優化檢測路徑后續的廣泛應用，通過收集更多的數據，將會證實新路徑在融合基因檢測方面的優勢。

本組優化后路徑平均檢測周期為2.84天，顯著少于常規檢測路徑的7.89天。日前，我國有學者在單中心研究中，經過優化將肺癌診斷和基因檢測時間縮短為平均4天(3～6天)[10]。本組經過優化，檢測周期進一步縮短，具有普遍推廣價值。

本組中使用的ARMS法多基因檢測試劑盒囊括肺癌相關多個基因和靶向治療相關的熱點驅動基因突變，ARMS法操作及結果判讀簡易，與單基因檢測以及二代測序相比，該檢測方法快速且全面，可對初治患者和耐藥突變患者進行準確的檢測，更適合于規范的優化路徑使用。

總之，本組綜合運用ROSE技術和ARMS法多基因檢測技術，將肺癌病理診斷和分子病理基因檢測平均周期縮短為3天內，且證實該路徑中病理診斷和基因檢測結果的準確性，可以大幅提高肺癌患者的診療速度，為患者選擇更好的診療策略提供保障。