血漿外泌體miRNA在肺癌組織學類型鑒別中的應用

趙子悅，陳玲玉，陶 瑞，王 瓊，趙大海，徐結茍

肺癌根據組織學特征可分為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)和小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)[1]。NSCLC主要由腺癌(adenocarcinoma, AC)和鱗狀細胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)組成[2]。肺癌的組織類型和分期主要依靠手術或穿刺標本、呼吸道細胞的病理檢查，而病理學檢查通常具有創傷性。因此，非侵入性的血清蛋白質、DNA以及非編碼RNA等生物學標志物檢測(即液體活檢)，已逐漸發展為病理檢查的替代方法。近年探討微小RNA(microRNA, miRNA)作為肺癌的早期篩查、療效和預后判斷顯示了良好的應用前景[3]，但其在區分肺癌組織類型的診斷價值方面尚未見報道。本實驗目的是篩選血漿外泌體miRNAs，結合傳統的肺癌標志物癌胚抗原(CEA)、細胞角蛋白片段19(CYFRA 21-1)和神經元特異性烯醇化酶(NSE)，以區分不同的肺癌組織類型，對不能經病理檢查確定組織類型的肺癌患者選擇最佳治療方案具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

1.1.1患者血漿miRNA高通量測序病例收集 收集2017年1～6月安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸與危重醫學科收治的慢性肺部炎癥、NSCLC和SCLC患者的血漿，各3例。肺癌患者的納入標準：(1)經活檢標本病理檢查確診為肺癌；(2)首次就診且未接受過手術、化療、放療等抗癌治療；(3)除肺癌外無其他癌癥。CT檢查排除慢性肺部炎癥患者的占位性病變。本實驗獲得安徽醫科大學倫理委員會批準。

1.1.2擴大肺癌患者miRNA篩查病例收集 選擇2017年6月～2018年12月安徽醫科大學第二附屬醫院呼吸重癥醫學科住院的肺癌患者80例。所有肺癌患者均經病理證實，其中肺AC 38例，SCC 20例，SCLC 22例，均接受常規化療。入選肺癌標準：(1)無手術切除腫瘤；(2)除肺癌外，無其他組織腫瘤；(3)住院期間無急性呼吸道炎癥。收集患者信息，包括年齡、性別、肺癌病理分期以及血清肺癌標志物CEA、NSE和CYFRA21-1。

1.2 方法

1.2.1患者血漿外泌體miRNA高通量測序 對慢性肺炎、NSCLC和SCLC患者的miRNA用Illumina HiSeq3000(上海晶能生物公司)進行高通量測序(合同號GN20180296)。選擇在NSCLC和SCLC組之間表達差異的miRNA(P<0.005)，并且通過以下標準進一步擴大肺癌患者miRNA篩查：(1)平均表達信號值的比率≥2.5，或≤0.4；(2)組中miRNA的表達信號不允許與其他組中的任何患者重疊。

1.2.2血漿外泌體miRNA提取 用miRNasy血清/血漿試劑盒(德國Qiagen公司)分離純化血漿外泌體miRNA，取患者血清2 mL。最終可得14 μL總RNA，RNA濃度測定后，樣品保存在-80 ℃，待用。

1.2.3候選miRNA的逆轉錄及qPCR 每個RNA樣品2 μL進行逆轉錄(莖環法)，根據試劑盒說明書，使用Hairpin-itTM miRNA和U6 snRNA，采用RT-PCR定量試劑盒(上海吉瑪)進行逆轉錄。逆轉錄后，根據試劑盒說明書，對4個候選miRNAs進行定量PCR。所選4個miRNA的引物堿基序列如下：正向引物分別為CGCGTAAGGTGCATCTAGTGC(miR-18a-5p)，ACTCGGCGTGGCGTCG(miR-1307-3p)，CGCGTGAGGCTGGAGG(miR-A堿基序列5′-UGAGGCUGGAGGAUCGCA-3′)和CGCGGGCGGGC GGCGG(miR-B堿基序列5′-GGCGGGCGGCGGAG GGGC-3′)，共同反向引物為AGTGCAGGGTCCGAG GTATT。以候選miRNA的模擬物(上海吉瑪公司)建立標準曲線，根據標準曲線計算各候選miRNA的血漿濃度。

1.3 統計學分析所有分析均采用SPSS 24.0軟件進行統計學分析。使用四分位數范圍的中位數計算患者隊列間臨床特征的差異。分類變量以數字和百分比表示。實驗和臨床實驗室結果的數據采用t檢驗或方差分析(ANOVA)進行評估。t檢驗以P<0.05的變量進一步納入Logistic回歸分析。對有顯著差異的變量采用二元Logistic分析進行檢驗，并以95%CI表示。通過受試者工作特征曲線下面積(AUROC)分析評估候選miRNAs單獨或聯合血清學生物學標志物的血漿水平對肺癌病理類型的預測能力。

2 結果

2.1 肺癌病理類型的候選血漿外泌體miRNA的篩選為探討血漿外泌體miRNA在NSCLC和SCLC中的表達差異，選擇NSCLC、SCLC和慢性肺部炎癥三組患者，每組各3例，進行血漿外泌體miRNA高通量測序。

首次篩選慢性肺炎組和肺癌組(NSCLC+SCLC)差異表達的miRNA(P<0.05)，共篩選出43個miRNA。為減少miRNA數量，進一步提高篩查的效率，在NSCLC和SCLC之間進行第二輪篩選。初步選擇了4個候選miRNA，包括miR-18a-5p、miR-1307-3p和2個新的miRNA(尚未正式命名，暫命名為miR-A和miR-B)作為進一步篩選的生物學標志物(表1)。

表1 肺癌中選中的候選miRNA的表達

2.2 AC、SCC和SCLC中候選血漿外泌體miRNA水平的測定為了解4種候選miRNA在肺癌組織學類型鑒別中的診斷價值，對80例肺癌患者血漿中4種候選miRNA進行qPCR檢測。患者信息包括年齡、性別、肺癌病理分期詳見表2。

表2 肺癌患者的臨床特點

對候選miRNAs進行qPCR分析顯示，AC組miR-A和miR-B的血漿濃度分別為19.33、212.73 fmol/L，顯著高于SCC組(6.08、28.43 fmol/L)和SCLC組(1.94、37.49 fmol/L)。AC和SCC中血漿中miR-18a-5p濃度分別為0.36、0.30 fmol/L，而SCLC為0.15 fmol/L。三組間miR-1307-3P水平差異無統計學意義(P>0.05)。血清CEA、NSE和CYFRA21-1水平在AC、SCLC和SCC中分別升高(表3)。

表3 候選miRNA和血清學生物學標志物的濃度

2.3 miR-A、miR-B和CEA與AC生物學標志物的關系AC中miR-A、miR-B和CEA均升高，依據AUROC曲線對這些生物學標志物進行單獨或聯合分析。miR-A、miR-B和CEA單獨預測AC的敏感性和特異性分別為52.6%和83.3%、68.4%和61.9%、55.3%和85.7%；當miR-A與CEA聯合預測時效果最佳(P<0.001)，曲線下面積(AUC)為0.823，敏感性為57.9%，特異性為95.2%，說明miR-A提高了CEA對AC的預測價值(表4，圖1)。

表4 生物學標志物對肺腺癌的診斷價值

圖1 AUROC分析血漿miR-A和miR-B以及血清CEA單獨或聯合檢測對肺腺癌的敏感性：A.血漿miR-A；B.血漿miR-B；C.血清CEA；D.聯合檢測

2.4 miR-18a-5p、miR-A和NSE與SCLC生物學標志物的關系SCLC患者血清中NSE濃度升高，miR-A和miR-18a-5p降低(表3)。因此，AUROC分析了這些參數對SCLC的診斷價值。NSE、miR-A和miR-18a-5p單獨診斷SCLC的敏感性和特異性分別為63.6%和79.3%、77.3%和56.9%、81.8%和55.2%(P值分別為0.001、0.021和0.010)。miR-A聯合NSE特異性最佳，特異性提高到89.7%(表5，圖2)，說明該組合是SCLC的潛在生物學指標。

圖2 AUROC分析血漿miR-A和miR18a-5p以及血清NSE單獨或聯合對小細胞肺癌診斷的敏感性：A.血漿miR-A；B.血漿miR18a-5p；C.血清NSE；D.聯合檢測

表5 生物學標志物對小細胞肺癌的診斷價值

3 討論

肺癌來源的外泌體miRNA在惡性腫瘤的發生、發展中起多種作用，并作為調節因子來調節信號轉導。如miR-21、miR-23a和miR-103a通過靶向不同的分子促進血管生成，從而負向改變免疫細胞的功能[4-6]；miR-21/miR-29a和miR-494/miR-542-3p可增強腫瘤轉移作用[7-8]。在臨床研究中，血漿或血清中外泌體miRNA視為檢測診斷/預后的生物標志物，或作為治療效果的預測因子[9]。這些研究大多集中在早期篩查、致癌機制和治療效果上。血漿外泌體miRNA作為區分不同組織類型肺癌的生物學標志物，對于晚期NSCLC和SCLC不能通過穿刺病理檢查的肺癌患者，判斷其組織學類型對化療、免疫治療等治療方案的選擇至關重要。液體活檢與傳統的病理活檢相比，更有優勢。外泌體miRNA從癌細胞或癌組織中釋放，并反映其來源細胞的miRNA表達模式[10-11]。因此，理論上可以通過檢測循環外泌體miRNA來區分不同的組織類型。本實驗發現2個新的miRNA(miR-A和miR-B)，特別是miR-A可作為肺AC和SCLC的潛在生物學標志物。循環miR-A單獨也可以作為AC的一個指標，其特異性為83.3%，臨界值為17.78 fmol/L；而與CEA聯合使用時，特異性可達95.2%；與傳統的血清學蛋白生物學標志物NSE聯用時，SCLC患者的特異性也提高到89.7%，臨界值≤8.81 fmol/L。因本組樣本量較少，需進一步驗證miR-A在肺AC和SCLC中的診斷價值，其在肺AC發生、發展中的作用也應進一步探討。

本組通過高通量測序實驗，選擇了4個外泌體miRNA作為區分肺癌組織學類型的候選生物學標志物。定量PCR檢測和AUROC分析顯示，miR-A與血清學生物學標志物CEA和NSE聯合使用具有較好的診斷價值，對肺AC和SCLC的特異性分別為95.2%和89.7%，臨界值分別為≥17.78和≤8.81 fmol/L。這些結果表明，miR-A聯合CEA或NSE是肺AC或SCLC潛在的診斷指標。